Livin基因在結(jié)腸癌組織芯片中的表達(dá)及其與Bcl—2相關(guān)性研究

李海波+池圣亮

[摘要] 目的 探討Livin基因在結(jié)腸癌組織芯片中的表達(dá)及其與Bcl-2相關(guān)性。 方法 選取結(jié)腸癌外科手術(shù)患者60例，采用免疫組化MaxVisionTM二步法檢測結(jié)腸癌組織芯片中Livin、Bcl-2基因的表達(dá)。另取切緣正常結(jié)腸組織芯片25例作對照。 結(jié)果 結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因陽性表達(dá)率（63.33%）顯著高于切緣正常的結(jié)腸組織芯片（24.00%）（χ2=10.93，P<0.01）。結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征無相關(guān)性（P>0.05），與浸潤深度、Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)腸癌組織芯片中Bcl-2基因陽性表達(dá)率（68.33%）顯著高于切緣正常結(jié)腸組織（4.00%）（χ2=29.22，P<0.01）。結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因表達(dá)與Bcl-2基因存在明顯的正相關(guān)（P<0.01）。多因素Logistic回歸分析提示，浸潤深度、Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)入模型（P<0.05）。 結(jié)論 Livin基因在結(jié)腸癌組織芯片的發(fā)病中扮演重要角色，與其惡性侵襲、轉(zhuǎn)移病理過程密切相關(guān)。Livin基因與Bcl-2基因的異常表達(dá)可能在結(jié)腸癌癌變中起協(xié)調(diào)作用。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌；免疫組化；Livin基因；病理特征

[中圖分類號] R735.3+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）35-0021-04

結(jié)腸癌是臨床較常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。腫瘤的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的增生及凋亡受抑制密切相關(guān)，尤其是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)障礙或表達(dá)異常在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起及其重要的作用。Livin基因是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族的新成員，在正常成人組織中無明顯的表達(dá)或表達(dá)較低，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在大部分腫瘤組織中表達(dá)異常[1，2]。Bcl-2是臨床較常用的一種凋亡相關(guān)基因， 與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[3]。Livin基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與Bcl-2的相關(guān)性研究目前國內(nèi)外報道較少[3，4]。本研究旨在觀察Livin基因在結(jié)腸癌組織芯片中的表達(dá)及其與Bcl-2的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月～2014年7月我院普外科就診結(jié)腸癌外科手術(shù)患者60例。納入患者：術(shù)前具有完整臨床資料，且均未進(jìn)行任何輔助化放療和免疫治療?；颊咧心?9例，女21例；年齡38 ～89歲，平均（63.1±7.1）歲。另取切緣正常結(jié)腸組織25例作對照研究，其中男16例，女9例；年齡39～86歲，平均（62.9±6.4）歲。結(jié)腸癌組與正常結(jié)腸組織在性別構(gòu)成和年齡分布方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 組織芯片的制備

用組織陳列儀在模板蠟塊上打出直徑為2 mm的小孔，選取HE染色下所見典型癌組織區(qū)域2 mm柱狀組織，按順序填在模板蠟塊中，將蠟塊表面壓平整，二次包埋后制成組織芯片，4～6 μm連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組化染色。

1.3 免疫組化染色

采用免疫組化MaxVisionTM二步法進(jìn)行檢測，具體步驟參照文獻(xiàn)[5]。采用已知陽性片和磷酸鹽緩沖液（PBS）分別行陽性對照或陰性對照，其中鼠抗人Livin單克隆抗體及免疫組化MaxVisionTM二步法試劑盒均購買自北京中杉金橋公司，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購自福州邁新生物有限公司。

1.4 免疫組化結(jié)果判定[6]

Livin陽性細(xì)胞定位于胞漿，Bcl-2陽性細(xì)胞定位于胞膜或細(xì)胞漿，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。按照染色百分比和強(qiáng)度判斷其結(jié)果。其中染色百分比<5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分；76%～100%為4分；染色強(qiáng)度得分無著色為0分；淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。如染色細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度得分乘積>1判斷為陽性（+），≤1判斷為陰性（-）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Speaman分析，Livin基因與各因素間的關(guān)系采用多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片免疫組化染色

制作組織芯片各位點(diǎn)排列整齊，厚薄一致，位點(diǎn)結(jié)構(gòu)保持良好，無位點(diǎn)脫落。Livin免疫組化陽性產(chǎn)物呈胞漿棕黃色細(xì)顆粒狀，Bcl-2免疫組化陽性產(chǎn)物呈胞漿或胞膜棕黃色細(xì)顆粒狀。

2.2 結(jié)腸癌及切緣正常結(jié)腸組織芯片中Livin基因表達(dá)

60例結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因陽性表達(dá)38例（63.33%）；而25例切緣癌旁正常結(jié)腸中Livin基因陽性表達(dá)僅6例（24.00%）。結(jié)腸癌組織中Livin基因陽性表達(dá)率顯著高于切緣正常結(jié)腸組織（χ2=10.93，P<0.01）。

2.3 結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因表達(dá)與病理特征的相關(guān)性

結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無明顯相關(guān)性（P>0.05），與浸潤深度、Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.4 結(jié)腸癌及切緣正常結(jié)腸組織芯片中的Bcl-2基因表達(dá)

60例結(jié)腸癌組織芯片中Bcl-2基因陽性表達(dá)41例（68.33%）；而25例切緣癌旁正常結(jié)腸組織芯片中Bcl-2基因陽性表達(dá)僅1例（4.00%）。結(jié)腸癌組織芯片中Bcl-2基因陽性表達(dá)率顯著高于切緣正常結(jié)腸組織（χ2=29.22，P<0.01）。

2.5 結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因表達(dá)與Bcl-2基因的相關(guān)性分析endprint

38例結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因陽性表達(dá)有 37例Bcl-2基因陽性表達(dá)；22例結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因陰性表達(dá)有4例Bcl-2基因陽性表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)分析示結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因表達(dá)與Bcl-2基因存在明顯正相關(guān)（r=0.74，P<0.01）。

2.6 Logistic回歸分析Livin基因與各因素間的關(guān)系

以Livin基因免疫組化結(jié)果為應(yīng)變量，以患者的性別、年齡、腫瘤大小、組織分化程度、浸潤深度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移標(biāo)準(zhǔn)為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)浸潤深度、Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)入模型（P<0.05）。見表2、3。

3 討論

Livin基因是IAPs家族中新的凋亡抑制基因，定位于20號染色體q13.3，分別編碼298個和280個氨基酸的Livin-α及Livin-β[7，8]。Livin基因的抗細(xì)胞凋亡機(jī)制主要通過抑制Caspase-3、7和9途徑和阻斷以線粒體為基礎(chǔ)的外源性及內(nèi)源性凋亡途徑來起到抗細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系較密切[2，9]。近年來Livin基因在胃腸道腫瘤中的表達(dá)，尤其是結(jié)腸癌組織中的表達(dá)已逐漸受到臨床的重視[10，11]。鄭國文[12]研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制因子Livin基因在大腸癌中起極其重要的作用，參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程。東星等[13]研究也發(fā)現(xiàn)Livin基因在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可望成為大腸癌生物及免疫干預(yù)的標(biāo)志。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因陽性表達(dá)率顯著高于切緣正常的結(jié)腸組織，可見Livin基因在結(jié)腸癌組織芯片中異常高表達(dá)，在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中扮演重要角色。

但有關(guān)結(jié)腸癌組織Livin基因的表達(dá)與腫瘤直徑、組織分化程度、浸潤深度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理特征的關(guān)系國內(nèi)外報道不一致，尚未形成統(tǒng)一的結(jié)論[14，15]。何剪太等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中Livin基因的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位、組織學(xué)類型、淋巴轉(zhuǎn)移和Dukes等生物學(xué)行為均無明顯關(guān)系，而與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及放化療存在明顯相關(guān)性，提示Livin基因可影響大腸癌的生物行為，使其更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。菅金波等[5]研究發(fā)現(xiàn)，凋亡抑制因子Livin與結(jié)腸癌患者的腫瘤浸潤深度、Dukes分期、臨床分期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性，提示其與腫瘤的惡性侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后過程明顯相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織芯片中Livin基因表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征無明顯相關(guān)性，與腫瘤的浸潤深度、Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理特征密切相關(guān)，同時Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，浸潤深度、Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)入模型。提示Livin基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與其病情的進(jìn)展關(guān)系密切，是Livin基因表達(dá)的危險因素，尤其是與腫瘤的惡性侵襲、轉(zhuǎn)移的病理過程密切相關(guān)?？梢奓ivin基因在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中扮演重要角色，參與病情的發(fā)生、發(fā)展過程。

腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多步驟、多基因共同作用的結(jié)果。Bcl-2是一個原癌基因，其功能是阻遏細(xì)胞凋亡，其過度表達(dá)已被證實(shí)存在于多種腫瘤組織中[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織芯片中Bcl-2基因陽性表達(dá)率顯著高于切緣正常結(jié)腸組織，可見Bcl-2基因在結(jié)腸癌組織中異常高表達(dá)，在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中扮演重要角色；同時研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中Livin基因表達(dá)與Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)，Livin基因與Bcl-2基因通過作用于細(xì)胞凋亡的不同階段而協(xié)同發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，從而在促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用[17，18]。Livin基因有望作為大腸癌的基因診斷及治療的新作用靶點(diǎn)，從而開辟生物治療結(jié)腸癌的新途徑。但Livin基因能否作為結(jié)腸癌新的腫瘤標(biāo)志物并應(yīng)用于臨床、Livin與放化療耐藥性的關(guān)系有待進(jìn)一步的深入研究。

總之，Livin基因在結(jié)腸癌組織芯片中異常高表達(dá)，并與腫瘤的浸潤深度、Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，說明Livin基因在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中扮演重要角色，與腫瘤的惡性侵襲、轉(zhuǎn)移的病理過程密切相關(guān)。Livin基因與Bcl-2基因的異常表達(dá)可能在結(jié)腸癌癌變中起協(xié)調(diào)作用。

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