HIF—1α與VEGF在稽留流產組織中的表達及意義

李艷麗+楊麗麗+高晗+袁毅翀+朱發霞+顏彬+吳緒峰

[摘要] 目的 探討HIF-1α與VEGF在稽留流產及正常早期妊娠絨毛組織中的表達及意義。 方法 選擇早期妊娠（對照組）及稽留流產（實驗組）患者各50例，用免疫組化SABC法分別檢測兩組患者絨毛組織中HIF-1α與VEGF的表達情況。 結果 HIF-1α在對照組中表達陽性率為42%，在實驗組表達陽性率為76%，差異有統計學意義（P<0.05）；VEGF在對照組中表達陽性率為100%，在實驗組表達陽性率為66%，差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組中HIF-1α和VEGF的表達無明顯相關關系（r=-0.298，P>0.05）；對照組中HIF-1α與VEGF的表達呈正相關（r=0.387，P<0.05）。 結論 HIF-1α及VEGF表達異常可能與稽留流產發生有關。

[關鍵詞] 稽留流產；HIF-1α；VEGF

[中圖分類號] R714.43 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）35-0127-03

稽留流產是一種特殊類型的自然流產，指宮內胚胎或胎兒死亡未及時排出者，早期者也稱胚胎停育。自然流產的發病率約為10%～15%。稽留流產的確切發病率不清楚，有報道稱約為流產人數的1%，且有逐年增高趨勢[1]。稽留流產的具體病因不明，常見的病因如染色體異常、激素水平異常、內膜容受性低、解剖結構異常、環境污染及特發性稽留流產等。這些病因導致胚胎停止發育的具體機制尚未闡明，目前也沒有系統的相關學說。我們周圍的空氣中氧濃度約為21%，而大多數成人器官內氧濃度僅2%～9%（生理性低氧），正常早期胚胎發育也是在低氧環境中完成的[2]。稽留流產的發生是否與胚胎不能適應低氧環境相關，目前國內外研究少有涉及。缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）是主要的氧濃度調節因子，血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是強有力的血管生成因子，兩者均在許多生理及病理狀態中起作用。本研究通過檢測正常早期妊娠及稽留流產患者絨毛組織中HIF-1α和VEGF的表達，探討稽留流產患者絨毛組織中HIF-1α、VEGF的表達情況及其與稽留流產發生的關系，為稽留流產的發病機制研究提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇稽留流產患者50例為實驗組，早孕自愿要求終止妊娠患者50例作為對照組。實驗組患者年齡18～30 歲，平均 23.6歲，月經周期規律，停經45～60 d，平均50.6 d，經臨床婦科檢查、血β-HCG、孕酮和B超檢查證實為宮內妊娠且胚胎停止發育；對照組患者年齡19～33 歲，平均24.5歲，月經周期規律，停經42～57 d，平均48.1 d，自愿要求終止妊娠，B超提示宮內妊娠，見心管搏動。兩組患者的年齡、孕產次、停經天數比較差異均無統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 終止妊娠均采用吸宮術。術前行白帶常規、血常規、心電圖及婦科檢查均無明顯異常。在負壓下（負壓400～500 mmHg）行吸宮術采集絨毛組織，并將絨毛組織用生理鹽水漂洗干凈后置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，連續切片（厚5 μm），行免疫組化檢測。

1.2.2 免疫組化檢測 切片經二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，免疫組化采用SABC法，嚴格按試劑盒（武漢博士德公司）說明書進行，0.3%H2O2甲醇室溫孵育30 min，0.1M PBS沖洗5 min×3次，枸櫞酸鈉修復液微波抗原修復，PBS沖洗，5%正常羊血清37℃孵育30 min，傾去血清，分別滴加一抗HIF-1α與VEGF（武漢博士德公司，1：100），4℃冰箱過夜，PBS沖洗，分別滴加生物素化二抗（1：100）50 μL，37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加SA/HRP（1：100）50 μL，37℃孵育30 min，PBS沖洗，新鮮配制的DAB顯色5 min，清水沖洗，蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。

1.2.3 結果判定 ①HIF-1α和VEGF在絨毛組織中的表達 HIF-1α主要表達于滋養細胞和合體滋養細胞的胞漿和間質，少量表達于胞核。VEGF主要表達于滋養細胞和合體滋養細胞的胞漿和間質，在胞核中無明顯表達。兩者陽性細胞表達均于鏡下出現淡棕黃色、棕黃色、棕褐色顆粒。②結果判定[3] 綜合顯微鏡下陽性細胞染色程度及陽性細胞百分比來判斷。每張切片隨機取5個400倍高倍鏡視野，進行染色強度計分和陽性細胞百分比計分。無明顯細胞著色為0分，著色呈淡棕黃色為1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞數無、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計0、1、2、3、4分。上述兩種計分結果相加，0～1分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。

1.3 統計學方法

使用SPSS12.0軟件進行數據統計。計數資料比較采用χ2檢驗。HIF-1α與VEGF在實驗組和對照組中的相關性采用直線相關Pearson相關系數分析。以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α在兩組患者絨毛組織中的表達

見表1。HIF-1α在對照組中表達陰性者29例，表達陽性者21例，陽性率42%；實驗組表達陰性者12例，表達陽性者38例，表達陽性率76%。HIF-1α在實驗組中表達陽性率高于對照組中陽性率（χ2=5.974，P<0.05）。

2.2 VEGF在兩組患者絨毛組織中的表達

見表1。VEGF在對照組中表達陽性率為100%；在實驗組表達陰性者17例，表達陽性者33例，表達陽性率為66%。VEGF在實驗組中表達陽性率低于對照組中陽性率（χ2=9.647，P<0.05）。endprint

2.3 HIF-1α和VEGF在兩組患者絨毛組織中表達的差異

見圖1。HIF-1α在實驗組中的表達高于對照組中的表達，差異有統計學意義（χ2=5.974，P<0.05）；而VEGF在實驗組中表達低于對照組，組間差異有統計學意義（χ2=9.647，P<0.05）。在對照組中，HIF-1α與VEGF的表達呈正相關（r=0.387，P<0.05）；在實驗組中，HIF-1α和VEGF的表達無明顯相關關系（r=-0.298，P>0.05）。HIF-1α在實驗組中表達高于對照組（χ2=5.974，P<0.05）；VEGF在實驗組中表達低于對照組（χ2=9.647，P<0.05）。在對照組中，HIF-1α與VEGF的表達呈正相關（r=0.387，P<0.05）；在實驗組中，HIF-1α和VEGF的表達無明顯相關關系（r=-0.298，P>0.05）。

3 討論

胚胎發育早期需要適應宮腔內相對低氧的環境。成功的妊娠依賴滋養細胞正確的胎兒胎盤血管生成，正確的血管生成才能為胚胎提供氧氣和營養物質[4]，使其適應低氧環境。若著床后絨毛血管生成不足，不能形成健康的血管網絡，則胚胎將不能如期發育而致妊娠丟失[5]。

血管內皮細胞生長因子（VEGF）是一種由血管內皮細胞、滋養細胞和炎性巨噬細胞等分泌且作用于血管內皮細胞促進其有絲分裂的細胞因子，被認為是最強有力的血管生成因子。VEGF不僅能刺激血管生成，還能增加血管通透性及抗細胞凋亡[6]。早期妊娠時，伴隨著胚胎的著床與植入、胚胎與子宮內膜之間血管的建立，VEGF大量產生[7]，在自然流產患者絨毛組織中VEGF表達則明顯下降[8]。本研究顯示，在正常妊娠絨毛組織（對照組）中，VEGF表達率100%，而在稽留流產組織中表達率僅66%，有明顯差異，與胡瑞華[9]等研究結果一致，說明VEGF正常表達是正常妊娠必不可少的條件之一，而其表達下降將導致妊娠失敗。缺氧誘導因子1α（HIF-1α）是1992 年由Semenza等找到的一種氧依賴轉錄激活因子，其表達受多個途徑誘導，對氧濃度極為敏感，是氧感受家族中的管家轉錄因子，是缺氧應答的全局性調控因子，為主要的氧濃度平衡調節因子[10]。低氧條件下，HIF-1α降解受抑制，能迅速合成和累積，從而調節其靶基因的轉錄[11]，在正常早期妊娠維持中起重要作用。HIF-1α促進血管生成的下游靶基因及作用機制尚未完全明確。在成人造血干細胞中，發現HIF-1α的兩大靶基因之一為VEGF。有研究者對血管內皮前體細胞中HIF-1α基因敲除的小鼠胚胎研究發現，基因敲除后血管前體細胞明顯減少，胚胎中血管生成明顯減少[12]。Yan Fang等研究表明[13]，正常早期妊娠人流絨毛組織中，HIF-1α表達增加，并通過Dll4/Notch信號轉導系統增加VEGF表達；稽留流產絨毛組織中HIF-1α表達進一步增高，但Dll4/Notch表達與HIF-1a-VEGF表達關系失衡，VEGF表達減少，這種調控機制被破壞可能是稽留流產發生的原因。HIF-1α在缺氧環境中的另一個作用是造成細胞凋亡[14，15]。RL95-2細胞系是研究子宮內膜容受性的良好載體，Xu BF等[14]曾對RL95-2細胞系在低氧條件下進行培養研究，發現隨著培養時間延長，細胞凋亡率逐漸增加，HIF-1α表達率也逐漸增加，推測HIF-1α有致細胞凋亡作用而降低子宮內膜容受性。本研究中，正常妊娠絨毛組織中HIF-1α表達率42%，而在稽留流產絨毛組織中表達率升高為76%，差異明顯；且對照組中，HIF-1α和VEGF表達呈正相關，說明增高的HIF-1α上調VEGF表達，而實驗組中HIF-1α和VEGF無明顯相關關系，說明稽留流產組織中HIF-1α表達雖進一步增加，但未能上調VEGF的表達。推測可能在稽留流產組織中，缺氧更為嚴重，HIF-1α表達增加更明顯，但因信號轉導系統被破壞，HIF-1α表達雖進一步增加，并未能引起VEGF表達相應增加，反而增加了細胞凋亡，導致稽留流產發生[15]。

總之，健康的血管網絡的形成是成功妊娠的重要條件。而稽留流產絨毛組織中HIF-1α雖表達增加，但VEGF合成仍減少，血管網絡不能如期形成導致妊娠失敗。尚需要更多的研究來進一步揭示稽留流產發生的機制。

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