宏基因組學(xué)在口腔微生物研究中的應(yīng)用進展*

車宇薇 王燕一

口腔是人體非常重要的微生態(tài)環(huán)境之一。口腔具有復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)和特殊的生理特點，在口腔中定植著繁復(fù)的微生物群落。在口腔龐大微生物組中僅有小部分可以培養(yǎng)，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術(shù)很大程度上局限了口腔微生物組的研究。宏基因組學(xué)技術(shù)通過高通量測序獲得樣本的所有目標(biāo)基因序列進行分析，可以直接從基因水平研究口腔微生物。該技術(shù)一方面可進行微生物生態(tài)學(xué)的研究，從微生物群落角度研究口腔微生物的多樣性及其變化；另一方面可進行口腔微生物基因組學(xué)的研究，并從中分析篩選新的功能基因及其產(chǎn)物。技術(shù)的發(fā)展為口腔微生物群落研究提供了手段，使口腔微生物群落與口腔、全身的疾病與健康關(guān)系的研究更加深入。

1. 宏基因組研究簡介

宏基因組(Metagenome)是指微生態(tài)環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和，包括可以進行培養(yǎng)的和現(xiàn)階段尚不能培養(yǎng)的微生物基因組。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物群基因組為研究對象，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及微生物與環(huán)境的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法[1]。宏基因組學(xué)的研究主要是是從環(huán)境樣本中提取DNA 或RNA，進行大規(guī)模測序，其主要策略如下：(1)采用引物PCR 技術(shù)擴增16S rDNA(主要是V6 區(qū))、16S rRNA 或其他遺傳標(biāo)記，然后對擴增產(chǎn)物測序(Amplicon sequencing)；(2)構(gòu)建宏基因組文庫，然后進行克隆測序(Clone sequencing)、生物活性水平篩選(即功能驅(qū)動篩選，F(xiàn)unction driven screening)、 序 列 驅(qū) 動 篩 選(Sequence driven screening)或底物誘導(dǎo)基因表達篩選(Substrateinduced geneexpression screening，SIGEX)；(3)直接進行鳥槍法測序。對測序產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，借助于生物信息學(xué)分析方法和具有數(shù)據(jù)組裝、基因預(yù)測、物種分類鑒定、功能注釋等功能的計算系統(tǒng)及軟件平臺進行分析。通過分析可發(fā)現(xiàn)大量曾經(jīng)未能獲得的未知微生物新基因或新的基因簇，從而對環(huán)境樣本微生物群落及其代謝功能進行深入的研究分析[2]。

2. 宏基因組學(xué)在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1 口腔微生物的研究方法 人類體內(nèi)有多于人體自身細胞數(shù)目數(shù)倍的微生物[3]。這些微生物中絕大部分在人正常的生理功能中發(fā)揮作用，如參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，維生素的合成和機體防御。口腔是人體微生物定植生存的重要生態(tài)區(qū)域之一，適宜的溫度、濕度，復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和豐富的營養(yǎng)來源，為口腔內(nèi)各種微生物的生長和定植提供了環(huán)境，從而也造就了口腔微生物群落豐富的多樣性[4]。現(xiàn)階段可鑒定出人類口腔寄居著500-700 種細菌[5]。1924 年J.K.Clarke 首次于口腔中分離出變形鏈球菌，此后對口腔微生物的認識主要通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法。但環(huán)境中可培養(yǎng)的細菌小于1%，故采用菌斑指示劑和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究口腔微生態(tài)有很大的局限性[6]。

隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)出現(xiàn)了一系列不依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的分子檢測手段，如：16S rRNA 克隆測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性/ 溫度梯度凝膠電泳(PCR-DGGE/ TGGE)、末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性高效液相色譜(PCR-DHPLC)、DNA 雜交技術(shù)等等[7]。這些技術(shù)應(yīng)用對臨床工作的指導(dǎo)和決策有重要意義，但通常只能對環(huán)境中的優(yōu)勢菌群進行檢測分析，檢測精度及分辨率有限，在某種程度上不能完整的反映整個口腔微生物群落的組成和動態(tài)變化。

2005 年誕生的454 和Solexa 新一代測序技術(shù)標(biāo)志著快速基因組測序時代的到來，以合成測序為核心的第二代測序技術(shù)和高通量基因芯片的出現(xiàn)是對傳統(tǒng)技術(shù)的革新[8，9]，分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展催生了宏基因組學(xué)這門嶄新的交叉學(xué)科。宏基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為土壤環(huán)境、海洋環(huán)境及人類胃腸等的微生物種群的研究提供了嶄新的視角，同時也翻開了口腔微生物研究的新篇章。2008 年美國福塞斯研究所和英國國王學(xué)院聯(lián)合建立了人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(HOMD，http:/ / www.homd.org)。該數(shù)據(jù)庫提供了人類口腔中約700 種原核生物種系的全面信息，記錄了13 個門目口腔微生物分類群的發(fā)育樹、基因組和16S rRNA 的信息。隨后的研究不斷豐富了這一成果：Keijser等[10]發(fā)現(xiàn)口腔微生物涵蓋22 個門318 屬，其中菌斑267 屬，約10000 個種系型，唾液185 屬，約5600 個種系型；Nasidze 等[11]還在唾液中發(fā)現(xiàn)了64個未知細菌種屬；A. Murat Eren 等[12]利用寡核苷酸配型分析口腔菌群微生物，第一次實現(xiàn)在亞種水平進行高分辨率的細菌分類。2010 年Ghannoum等[13]在人類口腔中檢測出85 種真菌屬，其中11 種尚未被培養(yǎng)。Willner 等[14]利用宏基因組學(xué)技術(shù)手段，首次分離并鑒定出了口腔DNA 病毒組。宏基因組學(xué)的不斷發(fā)展為研究口腔微生物的多樣性和復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)提供了重要的技術(shù)支撐。

2.2 宏基因組學(xué)在口腔微生物群落研究中的應(yīng)用 在傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和顯微鏡檢測技術(shù)時代，變異鏈球菌和乳桿菌等被認為是引起齲病的主要致病菌。隨著宏基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，齲病的相關(guān)研究進一步深入。Aas 等[15]發(fā)現(xiàn)齲病發(fā)展的不同階段以及恒牙與乳牙齲之間的細菌圖譜分布存在顯著差異，且在能檢測到變異鏈球菌的個體中，其他菌屬諸如奇異菌屬、丙酸菌屬以及乳酸菌屬也有較高的表達，除變異鏈球菌屬之外，韋榮菌屬、乳酸菌屬、放線菌屬、雙歧桿菌屬、低pH 的非變異鏈球菌屬、丙酸菌屬以及奇異菌屬都與齲病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。Hughes CV.等[16]對于兒童早期齲的研究發(fā)現(xiàn)遠源鏈球菌和耐酸細菌與嚴(yán)重的兒童早期齲相關(guān)，遠源鏈球菌而非變形鏈球菌在繼發(fā)齲中比例和數(shù)目遠高于無繼發(fā)齲組。Peterson SN 等[17]對未患齲和齲活躍兒童的乳牙列牙菌斑樣本進行16S rDNA 測序，分析鑒定出了約1372 個操作分類單元(OTU)，近一半的OTUs 在患齲與未患齲的牙菌斑微生物組中都很常見，且呈現(xiàn)了相似的豐度。兩組間的差異并非特定微生物種群的質(zhì)的不同，而是微生物特定種系型的量的改變。Li Y 等[18]的研究求分析發(fā)現(xiàn)，成人齲活躍人群和健康人群唾液樣品中無齲健康人群有更高的菌種多樣性，這一結(jié)果提示一部分口腔細菌可能在在齲活躍人群中出現(xiàn)缺失、被替換或者抑制。

宏基因組學(xué)技術(shù)也被應(yīng)用于牙周相關(guān)疾病的研究，使復(fù)雜的牙周疾病的研究進一步發(fā)展。Wang JF 等[19]對9 名健康人和7 名牙周炎患者的樣本宏基因組測序后發(fā)現(xiàn)健康人菌斑和口腔環(huán)境中的微生物菌屬主要為鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、羅氏菌屬和嗜二氧化碳纖維菌屬，占全部菌種的90%以上。而牙周炎患者口腔的微生物有更豐富的多樣性，其擬桿菌、放線菌、變形菌和厚壁菌屬豐度遠高于健康人。從基因的角度分析，在牙周炎患者中LPS 和PrtC 基因明顯增多，而細菌的合成代謝和分解代謝顯著降低，如編碼參與代謝硫和過氧化物的酶的基因嚴(yán)重不足。種植體周圍炎是導(dǎo)致種植體失敗的主要原因，其與牙周炎有類似的臨床表現(xiàn)，兩者之間可能存在一定關(guān)聯(lián)[20-22]。Kumar PS 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，種植體周圍炎生物膜的多樣性遠低于正常和牙周病狀態(tài)下的齦下生物膜。種植體周圍炎的優(yōu)勢菌屬是：丁酸弧菌屬、彎曲桿菌屬、真細菌屬、普氏菌屬、新月形單胞菌屬、鏈球菌屬、放線菌屬、纖毛菌屬、丙酸菌屬、消化球菌屬、乳酸球菌屬和密螺旋體屬。種植體周圍炎與正常種植體周圍相比有較低水平的普氏菌和纖毛菌屬，但放線菌、消化球菌、彎曲桿菌，非變異鏈球菌、丁酸弧菌和變異鏈球菌較高。由此表明種植體周圍炎是一種主要有革蘭氏陰性致病菌引起的特異性感染，其微生物群落構(gòu)成遠沒有牙周病復(fù)雜。

此外，F(xiàn)aust K 等[24]研究了口腔、胃腸、陰道等人體不同位置微生物群落間的共現(xiàn)情況，結(jié)果表明雖然大多數(shù)的微生物群落在全身不同部位沒有關(guān)聯(lián)，但有一小部分微生物(如厚壁菌屬等)如同各群落間的聯(lián)絡(luò)員，搭建起了全身的關(guān)聯(lián)，協(xié)調(diào)人體的整個微生物群體。以上觀點從微生物的角度驗證了口腔疾病與全身疾病存在潛在關(guān)聯(lián)。Willner 等[14]對健康人口咽部的病毒進行高通量測序技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)了可編碼血小板凝集因子PblA 和PblB 的，寄生于變異鏈球菌中的噬菌體sm-1 基因。Nakano K 等[25，26]學(xué)者也曾在心內(nèi)膜上發(fā)現(xiàn)了變異鏈球菌，以上結(jié)果表明口腔中寄生于變異鏈球菌的病毒與心臟疾病可能存在聯(lián)系。

2.3 宏基因組學(xué)在口腔微生物新型功能基因篩選中的應(yīng)用 宏基因組學(xué)技術(shù)除了能幫助我們研究微生物種群的結(jié)構(gòu)及其功能外，還可以用于發(fā)現(xiàn)新的基因和研發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。Xie G 等[27]利用第二代高通量宏基因組測序技術(shù)檢測健康人的牙菌斑，產(chǎn)生了約860，000，000 對非人類來源的基因片段。其中，約有73%能夠編碼蛋白質(zhì)，約有2.8%基因序列編碼與抗生素耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)，表明口腔微生物群落是研究抗生素耐藥性重要的基因庫。2003 年Diaz-Torres 等[28]采集了人類唾液標(biāo)本，通過構(gòu)建人類唾液宏基因組文庫，篩選出一種未曾獲得的四環(huán)素耐藥基因tet(37)。吳丹等[29]提取牙菌斑進行宏基因組測序，構(gòu)建Fosmid 文庫，其后用卡那霉素、四環(huán)素及氨芐西林進行篩選，篩選得到了一個氨基糖苷類雙功能修飾酶AacAAphD 基因、一個核糖體保護蛋白型四環(huán)素耐藥基因tet(M)和一個C 家族β-內(nèi)酰胺酶基因。這一實驗研究證實了宏基因組學(xué)技術(shù)可用于檢測篩選牙菌斑菌群中的抗生素耐藥基因。目前對于口腔微生物新的功能基因及其相關(guān)功能的研究還較少，在宏基因組學(xué)技術(shù)的輔助下，該領(lǐng)域的研究有很大的發(fā)展空間。

3. 結(jié)語

目前對口腔微生物的研究大部分仍局限于實驗室可培養(yǎng)的菌種，利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究口腔微生物多樣性和生物群落的功能代謝是必然趨勢。宏基因組學(xué)技術(shù)使我們能夠更深入的理解口腔微生物組成、結(jié)構(gòu)和功能，以及口腔和全身的健康與疾病的關(guān)系。目前臨床常見的診斷和檢測全身疾病的方法，如內(nèi)鏡檢查，血液檢查等均會對人體造成一定程度的損傷。利用宏基因組學(xué)研究方法，對口腔菌斑樣本或者唾液樣本中的菌群組成的動態(tài)監(jiān)控，可成為對人類健康狀況評估的一種新的非損傷性方法。技術(shù)的不斷發(fā)展為口腔微生物的研究提供了嶄新的舞臺，我們正面臨著極大的挑戰(zhàn)，有很多空白需要我們?nèi)ヌ钛a，有更多未知領(lǐng)域等待著我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

[1] Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured Microorganisms [J]. Microbiol Mol Biol Rev，2004，68(4):669-685

[2] 許 波，楊云娟，李俊俊，等.宏基因組學(xué)在人和動物胃腸道微生物研究中的應(yīng)用進展[J]. 生物工程學(xué)報，2013，29(12):1721-1735

[3] Ley RE，Peterson DA，Gordon JI. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine[J]. Cell，2006，124: 837-848

[4] Paster BJ，Boches SK，Galvin JL，et al. Bacterial diversity in human subgingival plaque[J]. J Bacteriol，2001，183(12):3770-3383

[5] Kazor CE，Mitchell PM，Lee AM，et al. Diversity of bacterial populations on the tongue dorsa of patients with halitosis and healthy patients[J]. J Clin Microbiol， 2003， 41 (2):558-563

[6] Rappé MS，Giovannoni SJ. The uncultured microbial majority[J]. Annu Rev Microbiol，2003，57:369-394

[7] He XS，Shi WY. Oral microbiology: past，present and future[J]. Int J Oral Sci，2009，1(2):47-58

[8] Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods[J].Annu Rev Genomics Hum Genet，2008，9:387-402

[9] Knights D，Costello EK，Knight R. Supervised classification of human microbiota[J]. FEMS Microbiol Rev. 2011，35(2):343-359

[10] Keijser BJ，Zaura E，Huse SM，et al. Pyrosequencing analysis of the oral microflora of healthy adults[J]. J Dent Res，2008，87(11):1016-1020

[11] Nasidze I，Li J，Quinque DT，et al. Global diversity in the human salivary microbiome[J]. Genome Res，2009，19(4):636-643

[12] Eren AM，Borisy GG，Huse SM，et al. Oligotyping analysis of the human oral microbiome[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，15，111(28):E2875-2884

[13] Ghannoum MA，Jurevic RJ，Mukherjee PK，et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals[J]. PLoS Pathog，2010，8，6(1):e1000713

[14] Willner D，F(xiàn)urlan M，Schmieder R，et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，15；108(Suppl 1):4547-4553

[15] Aas JA，Paster BJ，Stokes LN，et al. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity[J]. J Clin Microbiol，2005 ，43(11):5721-5732

[16] Hughes CV，Dahlan M，Papadopolou E，et al. Aciduric microbiota and mutans streptococci in severe and recurrent severe early childhood caries[J]. Pediatr Dent，2012，34(2):e16-23

[17] Peterson SN，Snesrud E，Liu J，et al. The dental plaque microbiome in health and disease[J]. PLoS One，2013，8(3):e58487

[18] Li Y，Ku CY，Xu J，et al. Survey of oral microbial diversity using PCR-based denaturing gradient gel electrophoresis[J]. J Dent Res，2005，84(6):559-564

[19] Wang J，Qi J，Zhao H，et al. Metagenomic sequencing reveals microbiota and its functional potential associated with periodontal disease[J]. Sci Rep，2013，3:1843

[20] 王 懿，劉洪臣. 種植體周圍炎治療方法的研究進展[J]. 中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，8(1)：45-48

[21] Tord b，Nicola UZ，Mauro D. peri-implantitis lesionsdifferent from periodontitis lesions[J]. Clin Periodontol，2011，38(Suppl 11)：188-202

[22] 吳 昊，劉洪臣.種植體周圍炎的易感因素研究現(xiàn)狀[J].口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志，2012，13(3):184-187

[23] Kumar PS，Mason MR，Brooker MR，et al. Pyrosequencing reveals unique microbial signatures associated with healthy and failing dental implants[J]. J Clin Periodontol，2012，39(5):425-433

[24] Faust K，Sathirapongsasuti JF，Izard J，et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome [J].PLoS Comput Biol，2012，8(7):e1002606

[25] Nemoto H，Nakano K，Nomura R，et al. Molecular characterization of Streptococcus mutans strains isolated from the heart valve of an infective endocarditis patient[J]. J Med Microbiol，2008，57(Pt 7)：891-895

[26] Nomura R，Nakano K，Nemoto H，et al. Isolation and characterization of Streptococcus mutans in heart valve and dental plaque specimens from a patient with infective endocarditis[J]. J Med Microbiol，2006，55(Pt 8)：1135-1140

[27] Xie G，Chain PS，Lo CC，et al. Community and gene composition of a human dental plaque microbiota obtained by metagenomic sequencing[J]. Mol Oral Microbiol，2010，25(6):391-405

[28] Diaz-Torres ML，McNab R，Spratt DA，et al. Novel tetracycline resistance determinant from the oral metagenome[J].Antimicrob Agents Chemother，2003，47(4):1430-1432

[29] 吳 丹，程 功，李 晶，等.牙菌斑培養(yǎng)菌群宏基因組文庫構(gòu)建及抗生素耐藥基因篩選[J].微生物學(xué)通報，2013，40(6):1041-1048