早幼粒細胞白血病蛋白的缺失對胃癌和結直腸癌預后的影響

林生力　陳藝樟　易拓　董天庚　洪信強　胡健衛　張震　牛偉新

(1. 復旦大學附屬中山醫院普外科， 上海　200032； 2. 第二軍醫大學衛生勤務學系， 上海　200433)

早幼粒細胞白血病蛋白的缺失對胃癌和結直腸癌預后的影響

林生力1△陳藝樟2△易拓1董天庚1洪信強1胡健衛1張震1牛偉新1

(1. 復旦大學附屬中山醫院普外科， 上海200032； 2. 第二軍醫大學衛生勤務學系， 上海200433)

摘要目的：研究早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein，PML)與胃腸腫瘤的關系,并探討PML與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)間的關系。方法： 采用免疫組化法檢測胃癌和結直腸癌中PML、EGFR、VEGF的表達情況，并分析它們與腫瘤侵襲、淋巴結轉移、TNM分期以及患者生存率之間的關系。結果： PML在胃腸癌旁正常組織中均呈陽性表達，其在胃癌組織中的缺失率為33.8%(54/160)，在腸癌組織中的缺失率為38.1%(64/168)。胃癌組織中PML缺失與腫瘤侵犯程度(P<0.001)、淋巴結轉移(P=0.018)以及TNM分期(P<0.001)正相關；PML陽性患者較PML陰性患者生存期長(52個月 比 39個月，P<0.001)；年齡、PML表達與否以及TNM分期情況是影響胃癌預后的獨立危險因素。結直腸癌組織中PML缺失與TNM分期(P=0.012)正相關，PML陽性患者較PML陰性患者生存期長(53個月 比 44個月，P=0.001)；結直腸癌組織中EGFR陽性表達與腫瘤組織侵犯程度(P<0.001)、淋巴結轉移(P<0.001)以及TNM分期(P<0.001)正相關；PML是否缺失、TNM分期情況以及EGFR表達與否是影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素。PML表達與EGFR和 VEGF的表達負相關(P<0.05)。結論： PML缺失可能通過上調EGFR和VEGF的表達而促進胃癌和結直腸癌的進展；PML缺失與胃癌和結直腸癌患者的預后相關。

關鍵詞早幼粒細胞白血病蛋白；胃癌；結直腸癌；表皮生長因子受體；血管內皮生長因子

中圖分類號R 735.2

文獻標識碼A

Effect of Promyelocytic Leukemia Protein Deficiency on Prognosis of Gastric and Colorectal CancersLINShengli1△CHENYizhang2△YITuo1DONGTiangeng1HONGXinqiang1HUJianwei1ZHANGZhen1NIUWeixin1

1.DepartmentofGeneralSurgery,ZhongshanHospital，FudanUniversity,Shanghai200032,China； 2.FacultyofHealthService,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

AbstractObjective： To study the relation between promyelocytic leukemia protein (PML) and gastric and colorectal cancers, and explore the relation between PML and epidermal growth factor receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Methods： The expression situations of PML, EGFR, and VEGF in gastric and colorectal cancer were detected by immunohistochemistry, and their relations with tumor invasions, lymph node metastases, TNM stages and patients’ survival were analyzed. Results： PML was positively expressed in normal tissue adjacent to gastrointestinal cancer. The rate of PML deficiency was 33.8%(54/160) in gastric cancer tissue, while it was 38.1%(64/168) in colorectal cancer tissue. PML deficiency in gastric cancer tissue was positively correlated with gastric wall invasion (P<0.001), lymph node metastases (P=0.018) and TNM stage (P<0.001), and the survival period of patients with positive PML was longer than that of patients with negative PML (52 months vs 39 months,P<0.001). Age, PML deficiency and TNM stage were the independent risk factors of gastric cancer prognosis. PML deficiency in colorectal cancer tissue was positively correlated with TNM stage (P=0.012), and the survival period of patients with positive PML was longer than that of patients with negative PML (53 months vs 44 months,P=0.001). The positive expression of EGFR was positively correlated with colorectal wall invasion (P<0.001), lymph node metastases (P<0.001) and TNM stage (P<0.001). PML deficiency, TNM stage and EGFR expression were the independent risk factors of colorectal cancer prognosis. PML expression was negatively correlated with EGFR and VEGF expression (P<0.05). Conclusions： PML deficiency may promote the progression of gastric and colorectal cancer by up-regulating the expression of EGFR and VEGF. PML deficiency is correlated with prognosis of gastric and colorectal cancer patients.

Key WordsPromyelocytic leukemia protein;Gastric cancer;Colorectal cancer;Epidermal growth factor receptor;Vascular endothelial growth factor

早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein，PML)最初引起研究者注意是在急性早幼粒白血病患者中。位于第15號染色體上的 PML基因和位于第17號染色體上的維甲酸受體α(retinoic acid receptor α， RARα)基因發生不平衡異位，形成PML-RARα融合基因后表達PML-RARα蛋白，阻礙了PML和RARα的正常生理功能，從而誘發急性早幼粒細胞白血病。體內PML主要以PML核體(PML nuclear body, PML-NB)的形式存在于胞核及胞質，PML-NB與體內數十種蛋白有相互作用，包括Daxx、p53、Sp100、CREB(cAMP-responsive element-binding protein)以及泛素化修飾相關蛋白[1-3]。PML-NB如同細胞內的蛋白加工車間，負責加工修飾各種蛋白，從而影響細胞的分化生長等行為。

越來越多的證據表明，PML是腫瘤抑制因子，可以調控細胞的生長、衰老及凋亡。缺失PML基因的小鼠比正常小鼠更易罹患腫瘤[4]。目前一些關于PML與前列腺癌、肺癌、黑素瘤以及血液腫瘤干細胞關系的研究[5-6]證實，缺失PML的患者病情進展更迅速，預后更差。一般認為，PML位于信號轉導通路上游，可以調控p53之類的分子，也可影響腫瘤中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的表達，可被泛素化修飾蛋白降解，但具體分子機制仍有待研究。目前，國內關于PML與腫瘤關系的研究多局限于血液系統腫瘤，在胃腸道腫瘤方面鮮有涉及。本研究采用免疫組化法檢測PML在中國胃癌和結直腸癌患者的癌組織及癌旁正常組織中的表達情況，以明確PML與胃腸腫瘤的關系并探討可能的分子機制。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2008—2010年在復旦大學附屬中山醫院就診的160例胃癌患者以及168例結直腸癌患者。胃癌組男性106例，女性54例，平均年齡61.32歲。結直腸癌組男性88例，女性80例，平均年齡69.01歲。兩組患者均由同一胃腸專科手術組的醫師進行胃癌或結直腸癌根治手術治療；術前均未行放化療；術后胃癌組腫瘤累及固有肌層或淋巴結有轉移者接受化療，結直腸癌組腫瘤累及肌層或淋巴結有轉移者接受化療，直腸癌患者增加放療。

1.2方法標本取樣：胃癌患者癌組織取自胃癌組織邊緣與正常胃黏膜組織交界處；胃癌患者正常組織取自距胃癌組織邊緣5 cm以上的正常胃黏膜組織。結直腸癌患者癌組織取自腸癌組織邊緣與正常腸道黏膜組織交界處；結直腸癌患者正常組織取自距腸癌組織邊緣10 cm以上的正常腸道黏膜組織。

用EnVision法進行PML免疫組化染色：PML一抗為1∶100稀釋的兔抗人PML ab53773抗體(英國Abcam公司)，二抗為抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE(丹麥Dako Denmark A/S公司)。采用二級計分法，根據陽性細胞所占比例(觀察5個以上高倍鏡視野)計分， 0%～5%為0分， 5%～25%為1分； 25%～50%為2分； 50%～75%為3分；>75%為4分。染色強度計分：無著色為0分；淡黃色為1分；黃或深黃色為2分；褐或棕褐色為3分。定義陽性細胞比例計分乘以染色強度計分大于1者為陽性結果。

EGFR(胃癌中為HER-2)和血管內皮生長因子的免疫組化染色由復旦大學附屬中山醫院病理科負責，方法均為DAB顯色法：EGFR一抗為羅氏4B5(瑞士羅氏制藥有限公司)，二抗為羅氏Ventana專用HRP試劑盒(瑞士羅氏制藥有限公司)；VEGF一抗為Abcam VG-1(英國Abcam公司)，二抗為Leica Bond DS9800試劑盒(美國Leica Biosystems公司)。

1.3統計學處理建立病例統計量化表格及數據庫，采用SPSS 13.0軟件進行分析，所有檢驗和P值均為雙側。免疫組化染色陽性率的比較采用χ2檢驗；單因素生存分析采用Kaplan-Meier分析，多因素生存分析采用Cox多元回歸法。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1PML的表達情況免疫組織化學染色結果顯示，對于160例胃癌患者，PML在癌旁正常組織中均呈陽性表達(圖1)，在癌組織中有54例表達缺失，缺失率33.8%(圖2)；對于168例結直腸癌患者，PML在癌旁正常組織中均呈陽性表達(圖3)，在癌組織中有64例表達缺失，缺失率38.1%(圖4)。

2.2PML與胃癌、結直腸癌患者的臨床病理特征的關系胃癌患者中，PML的缺失與腫瘤組織侵犯程度(P<0.001)、淋巴結轉移(P=0.018)以及TNM分期(P<0.001)正相關，而與性別、年齡等無相關，見表1。結直腸癌患者中，PML的缺失與TNM分期(P=0.012)正相關，而與性別、年齡、腫瘤組織侵犯程度和淋巴結轉移無相關，見表2。

A：×50，B：×100，C：×200，D：×400

圖1PML在癌旁正常胃組織中的表達情況

A、B為PML陽性；C、D為EGFR(HER-2)陽性；E、F為VEGF陽性。其中A、C、E為×100視野，B、D、F為×200視野

圖2胃癌組織中PML、EGFR(HER-2)、VEGF的表達情況

A：×50，B：×100，C：×200，D：×400

圖3PML在癌旁正常腸組織中的表達情況

2.3PML與胃癌和結直腸癌患者預后的關系胃癌患者中，PML陰性者的平均生存時間為 39.122 個月，PML陽性者的平均生存時間為 52.068 個月，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。結直腸癌患者中，PML陰性者平均生存時間為44.292個月，PML陽性者平均生存時間為53.482個月，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

2.4胃腸腫瘤組織中EGFR和VEGF的表達與臨床特征的關系為了進一步了解PML在胃腸腫瘤中的作用機制，我們檢測了EGFR(胃癌病例中為HER2)和VEGF在胃腸腫瘤組織中的表達情況，見圖2、圖4。

胃癌患者中EGFR和VEGF的表達與性別、年齡、腫瘤侵犯程度、淋巴結轉移、TNM分期無相關性(表1)。結直腸癌患者中EGFR陽性表達與腫瘤組織侵犯程度(P<0.001)、淋巴結轉移(P<0.001)以及TNM分期(P<0.001)正相關(P<0.05)，而與性別、年齡無相關性；結直腸癌患者中，VEGF陽性表達與性別、年齡、腫瘤侵犯程度、淋巴結轉移、TNM分期均無相關性(表2)。

A、B為PML陽性；C、D為EGFR陽性；E、F為VEGF陽性。其中A、C、E為×100視野，B、D、F為×200視野

2.5PML與EGFR、VEGF表達的負調控關系胃癌、結直腸癌患者中，PML的表達與EGFR、VEGF的表達均負相關(P<0.05)，見表3～4。

2.6胃癌、結直腸癌患者預后的多因素分析胃癌患者中，年齡、腫瘤組織中PML表達與否以及TNM分期情況是影響預后的獨立因素(表5)；結直腸癌患者中，患者腫瘤組織中PML表達與否、TNM分期情況以及EGFR表達情況是影響預后的獨立因素(表6)。

3討論

鑒于胃癌和結直腸癌的生物學特性及臨床病理特征的差異，本研究中對胃癌和結直腸癌分別進行了分析。本研究證實PML是腫瘤抑制因子，在胃癌和結直腸癌患者的正常組織中PML均呈陽性表達，而在胃癌和結直腸癌組織中有1/3的標本中PML表達缺失， PML表達缺失的患者的TNM分期及預后相對較差。

一般而言，胃癌和結直腸癌的預后與T分期、N分期相關。雖然本研究中胃腸腫瘤患者的預后與TNM分期相關，但T分期、N分期并不是預后的獨立影響因子。這可能與本研究的樣本量較少有關，還可能與T分期、N分期高的胃腸腫瘤患者通常在術后進行化療有關；此外，本研究以T1/2、T3/4，N0、Nx劃分T分期和N分期可能過于籠統導致統計上未能體現出T分期、N分期的臨床意義。這些問題有待在后續的研究設計中改進。

PML發揮對腫瘤的抑制作用時位于信號通路上游，通過影響下游某些信號分子的表達而直接改變細胞的分化增殖能力[7]。通常認為，EGFR和VEGF可以促進腫瘤的發生發展。Kuo等[8]的研究證實，在肺癌發生發展過程中，PML通過抑制EGFR的表達而起到抑制腫瘤的作用；而Bernardi等[9]的研究則顯示，乏氧微環境中PML通過抑制mTOR-HIF1α-VEGF信號通路而阻礙了腫瘤的進展。受此啟發，本研究同時檢測了胃腸腫瘤中EGFR(胃癌中為HER-2)和VEGF的表達，并分析了它們與PML表達的相關性，結果顯示，PML與EGFR、VEGF的表達均負相關。因PML居于信號調控上游，故推測PML是EGFR和VEGF的負調控因子。另一方面，也可認為胃腸腫瘤中PML的缺失激活了EGFR和VEGF的表達，從而促進了腫瘤的發生發展，這或許是本研究中胃癌和結直腸癌患者中PML缺失者的分期及預后相對較差的原因。然而，多因素分析發現，PML是胃癌和結直腸癌患者預后的獨立影響因素，而EGFR僅在結直腸癌患者中是預后的獨立影響因素。因此，不能簡單地認為，在缺失PML的胃癌、結直腸癌患者中，由于體內EGFR或VEGF的表達上調而促進腫瘤進展并影響預后。PML失活對腫瘤進展的促進作用不能完全通過EGFR或VEGF相關信號通路解釋，可能有其他信號通路參與調控。

綜上所述，在胃癌、結直腸癌患者中，PML與EGFR和VEGF有負調控關系。PML缺失影響胃腸腫瘤發生發展的具體分子機制尚待進一步研究，EGFR和VEGF相關信號通路可能只是錯綜復雜的信號調控網絡中的一環。

參考文獻

[1]Fausti F, Di Agostino S, Cioce M, et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence[J]. Cell Death Differ,2013,20(11):1498-1509.

[2]Corpet A, Olbrich T, Gwerder M, et al. Dynamics of histone H3.3 deposition in proliferating and senescent cells reveals a DAXX-dependent targeting to PML-NBs important for pericentromeric heterochromatin organization[J]. Cell Cycle,2014,13(2):249-267.

[3]Perusina LM, Mostafa HH, Davido DJ. Two overlapping regions within the N-terminal half of the herpes simplex virus 1 E3 ubiquitin ligase ICP0 facilitate the degradation and dissociation of PML and dissociation of Sp100 from ND10[J]. J Virol,2013,87(24):13287-13296.

[4]Salomoni P, Ferguson BJ, Wyllie AH, et al. New insights into the role of PML in tumour suppression[J]. Cell Res,2008,18(6):622-640.

[5]Gurrieri C, Capodieci P, Bernardi R, et al. Loss of the tumor suppressor PML in human cancers of multiple histologic origins[J]. J Natl Cancer Inst,2004,96(4):269-279.

[6]趙志龍，黃青遠，許順，等. 早幼粒細胞白血病蛋白在肺癌中的表達及其臨床意義[J]. 中華醫學雜志,2006,86(47):3362-3366.

[7]Imani-Saber Z, Ghafouri-Fard S. Promyelocytic leukemia gene functions and roles in tumorigenesis[J]. Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(19):8021-8028.

[8]Kuo HY, Chen YC, Chang HY, et al. The PML isoform Ⅳ is a negative regulator of nuclear EGFR’s transcriptional activity in lung cancer[J]. Carcinogenesis,2013,34(8):1708-1716.

[9]Bernardi R, Papa A, Egia A, et al. Pml represses tumour progression through inhibition of mTOR[J]. EMBO Mol Med,2011,3(5):249-257.