西格列汀對2型糖尿病小鼠胰島β細胞自噬相關因子表達的影響

吳彥菊，關一夫

(中國醫科大學，沈陽110122)

西格列汀是一種二肽基肽酶4(DPP-4)抑制劑，是治療2型糖尿病的新型藥物。其主要通過高選擇性抑制DPP-4，增加血中有活性胰高血糖素樣多肽1(GLP-1)，促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，發揮改善血糖調控的作用，且低血糖等不良反應發生率低［1～3］。研究表明，西格列汀單一及聯合用藥，具有抑制胰島β細胞凋亡，促進β細胞增殖，改善胰島β細胞功能的作用［3～5］。但是，其改善胰島β細胞功能的確切機制尚需深入研究。胰島β細胞功能進行性衰竭是2型糖尿病發生、發展的重要機制。有研究在2型糖尿病患者胰島β細胞中檢測到了自噬體及自噬相關因子的表達［6］，提示自噬參與胰島β細胞進行性衰竭的過程。2014年4～9月，我們從動物整體水平探究西格列汀對胰島β細胞自噬相關因子 Atg12、Atg3及 Beclin1表達的影響，觀察其與改善胰島β細胞功能的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性db/db小鼠，共30只，由南京模式動物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型構建及分組 西格列汀(默沙東，美國);RNA提取試劑盒(Omega，美國);逆轉錄試劑盒(Thermo，美國);RT-PCR試劑盒(Takara，日本);兔抗Beclin1抗體(Abcam，美國);抗胰島素抗體(Cell Signaling Technology，美國);抗胰高血糖素抗體(Abcam，美國);標記Alexa-488及Alexa-596的二抗(Jackson，美國);SABC免疫組化試劑盒(博士德，武漢)。胰島素 ELISA試劑盒(Millipore，美國)。酶標儀(Thermo，美國)，血糖儀及試紙(強生，美國)，低溫立式離心機(KUBOTA，日本)，熒光定量 PCR 儀(ABI，美國)，化學發光儀(Thermo，美國)，共聚焦顯微鏡(OLYMPUS，日本)。適應性喂養1周后，經尾靜脈取血檢測血糖，30只小鼠血糖均超過16.7 mmol/L，視為糖尿病動物模型構建成功。將db/db小鼠隨機為2組:糖尿病對照組(DC組)與西格列汀治療組(DT組)，每組15只。DT組小鼠每日晨9時灌胃給予西格列汀(80 mg/kg)1次，DC組小鼠給與等體積飲用水灌胃，共干預5周。實驗用db/db小鼠飼養于屏障環境中，鼠籠、飲水瓶等用具均經高壓滅菌消毒，SPF級飼料喂養，每日更換墊料及飲用水，維持室溫24～26℃，濕度55% ～65%，12 h照明。

1.2.2 標本收集 治療5周后，將所有小鼠以頸椎脫臼法處死，打開腹腔，剝離完整胰腺;生理鹽水沖洗，將胰腺從中央剖成兩部分，一半凍存于液氮中，用于提取RNA及組織胰島素;另一半浸泡于4%多聚甲醛溶液固定，以制備石蠟切片。血標本以心臟穿刺法采取，4℃離心(3 000 r/min，10 min)后，分離血清，－20℃冰箱中儲存。

1.2.3 血糖水平檢測 實驗期間，每周給藥前檢測小鼠血糖1次，血標本經尾靜脈穿刺采取，血糖值以強生血糖儀檢測，采血前小鼠禁食2 h。

1.2.4 血清及胰腺組織胰島素檢測 血標本經尾靜脈穿刺采取，ELISA法檢測血清胰島素。取綠豆大小胰腺組織，加入1 mL預冷的鹽酸乙醇溶液，冰上充分研磨，4℃孵育16 h。4℃離心(12 000 r/min，5 min)后，取上清，ELISA法檢測胰島素濃度。向各樣品離心后的沉淀中加入1 mL RIPA裂解液，制備蛋白樣品，并測定蛋白濃度。測得胰島素濃度與蛋白濃度的比值即為各樣品組織胰島素的含量。

1.2.5 胰腺組織胰島素與胰高血糖素檢測 采用免疫熒光染色。胰腺組織石蠟切片的處理流程與免疫組化一致。加入稀釋后的抗胰島素抗體(1∶800)與胰高血糖素抗體(1∶2 000)，4℃孵育14 h;Alexa-488及Alexa-596標記的二抗(1∶200)，室溫孵育2 h;加入熒光二抗后，所有操作均避光;甘油封片，共聚焦顯微鏡觀察并拍照(×200)。胰島素陽性染色區即β細胞呈現紅色熒光，胰高血糖素陽性染色區即α細胞呈現綠色熒光。

1.2.6 胰腺組織Caspse3活性檢測 將1 mL預冷的RIPA裂解液加入黃豆大小胰腺組織中，冰上研磨，孵育30 min。4℃離心(12 000 r/min，20 min)后，取上清，BCA法測定蛋白濃度。按照Caspase3活性檢測試劑盒的說明進行操作，以化學發光儀檢測待測樣品的生物熒光強度(RLU)。測得生物熒光強度(RLU)與蛋白含量(μg)的比值即為各樣品有活性Caspase3的含量。

1.2.7 胰島 β 細胞 Atg3、Atg12及 Beclin1基因檢測 采用實時熒光定量PCR法。按照Omega試劑盒操作指南提取總RNA;逆轉錄為cDNA。引物以Primer5.0軟件設計，由金思瑞生物科技公司合成，序列如下:Atg3引物:上游 5'-ACGCTGGAGGTGAAGATG-3'，下 游 5'-CCTGCATGGGTGAACTGA-3'，擴增產物長度為236 bp。Atg12引物:上游5'-TTGGAGGCATAGACAGACAC-3'，下游 5'-TATGTGTATTCCGTGCCATC-3'，擴增產物長度為 200 bp。Beclin1引物:上游5'-GTTGCCGTTATACTGTTCTG-3'，Beclin1 下游 5'-CCTCCAGTGTCTTCAATC-3'，擴增產物長度為 180 bp。GAPDH引物:上游 5'-CCATGTTTGTGATGGGTGTGAACCA-3'，下游 5'-ACCAGTGGATGCAGGGATGATGTTC-3'，擴增產物長度為 251 bp。反應體系(25 μL):cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，上、下游引物(濃度 5 μmol/L)各 1 μL，滅菌蒸餾水 8.5 μL。反應條件:預變性95 ℃，30 s;變性95 ℃，30 s;退火58 ℃，30 s;延伸72℃，30 s;共38個循環。以GAPDH為管家基因，計算各基因的相對表達。

1.2.8 胰島β細胞Beclin1蛋白檢測 將固定后的胰腺組織制備成4 μm的石蠟切片，經脫蠟、水化等處理后，采用SABC法檢測Beclin1蛋白表達。滅菌PBS稀釋的抗Beclin1抗體(1∶100)，4℃孵育14 h;HRP標記的二抗37℃孵育30 min;DAB顯色，蘇木素復染并封片。倒置顯微鏡觀察胰島組織，每張切片選取3個不重疊視野拍照(×400)，Image proplus軟件計算胰島Beclin1陽性表達區的平均光密度值。

1.2.9 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血糖水平比較 見表1。

表1 兩組血糖水平比較(n=15，±s)

表1 兩組血糖水平比較(n=15，±s)

組別 血糖(mmol/L)第1周 第2周 第3周 第4周 第5周DC 組 21.55 ±3.14 24.26 ±3.13 26.50 ±3.01 28.54 ±3.16 30.96 ±2.92 DT 組 21.66 ±2.83 24.08 ±2.22 24.49 ±2.00 23.78 ±1.89 22.17 ±1.94 t 0.11 0.18 2.16 4.98 9.70 P 0.916 0.856 0.039 0.000 0.000

2.2 兩組血清胰島素及組織胰島素比較 見表2。

表2 兩組血清胰島素及組織胰島素比較(±s)

表2 兩組血清胰島素及組織胰島素比較(±s)

組別 n 血清胰島素(ng/mL)組織胰島素DC組6 5.02 ±0.83 15.39 ±3.51 DT 組 6 7.34 ±0.96 33.31 ±3.73 t 4.46 8.56 P 0.001 0.000

2.3 兩組胰腺組織胰島素與胰島血糖素檢測結果DC組小鼠胰島α細胞(胰島素)散布于胰島中，所占比例大;DT組小鼠β細胞(胰島血糖素)所占比例大，分布于胰島的中央，α細胞分布于胰島的周邊，所占比例小。見插頁Ⅲ圖9。

2.4 兩組胰腺組織 Caspase3活性比較 DC組caspase3 活性為3.07 ±0.73，DT 組為1.72 ±0.42，t=3.94，P=0.002。

2.5 兩組胰島β細胞Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA相對表達比較 見表3。

表3 兩組胰島β細胞Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA相對表達比較(±s)

表3 兩組胰島β細胞Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA相對表達比較(±s)

組別 n Atg3 Atg12 Beclin1 DC組8 0.290 ±0.060 0.024 ±0.005 0.165 ±0.019 DT 組 8 0.174 ±0.039 0.019 ±0.013 0.087 ±0.013 t 4.546 8.088 9.426 P 0.001 0.000 0.000

2.6 兩組胰島β細胞Beclin1蛋白表達比較 棕黃色染色區即為Beclin1陽性表達區，主要位于胰島β細胞胞質，見插頁Ⅲ圖10。半定量分析發現，DC組與DT組小鼠胰島β細胞Beclin1蛋白表達分別為 12.37 ±2.11和 7.43 ±1.23，P ＜0.01。

3 討論

西格列汀無論短期還是長期治療均可發揮降糖及改善胰島β細胞功能的作用［4，5］。在本研究中，西格列汀治療降低了2型糖尿病小鼠的血糖水平。免疫熒光染色結果顯示，西格列汀治療后，糖尿病小鼠胰島β細胞所占比例大，位于胰島的中央，α細胞位于胰島周邊，分布趨于正常。進一步檢測胰島素水平發現，DT組小鼠血清胰島素及組織胰島素水平較DC組顯著增加，提示西格列汀治療增強了糖尿病小鼠胰島β細胞合成及分泌胰島素的能力，改善血糖調控及β細胞功能。

既往研究表明，拮抗β細胞凋亡是西格列汀改善胰島β細胞功能的重要機制［7］。隨著研究者對自噬深入探究，逐步發現自噬與細胞凋亡密切相關。自噬，又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是指將細胞中的大分子物質和細胞器等運輸至自噬溶酶體進行大量降解的生物學過程［8］。Beclin1、Atg3及 Atg12等多種自噬相關蛋白參與自噬體的形成，并通過多種機制調節細胞凋亡。本研究已在糖尿病小鼠胰島β細胞中檢測到Atg3、Atg12及Beclin1等自噬相關因子的表達，且西格列汀治療后，2型糖尿病小鼠胰島β細胞中自噬相關因子Atg3、Atg12及Beclin1的表達顯著減低，伴Caspase3活性降低。Caspase3是細胞凋亡的終末執行者，其活性降低表明西格列汀治療拮抗了β細胞凋亡。Beclin1，哺乳動物體內發現的自噬相關基因，主要參與自噬泡膜與溶酶體膜融合的調節［9］。研究發現，過表達自噬基因 Beclin1，可顯著增加細胞凋亡率［10］，說明Beclin1是誘發細胞凋亡的重要因子。目前認為，Beclin1主要通過與Bcl-2蛋白作用調控凋亡［11］。Atg12，泛素樣蛋白家族成員，主要參與自噬體膜延伸的調節［12］，亦通過不同的機制調節細胞凋亡。在Atg12結構中，含有一個BH3樣結構域，能與Bcl-2家族成員如Bcl-2、Mcl-1結合，拮抗其抗凋亡的作用，從而引發細胞凋亡［13］。Atg3，LC3泛素樣系統中的一員，可催化可溶性LC3-I轉變為脂溶性LC3-Ⅱ，調節自噬泡膜融合與延伸［14］。Wang等［15］研究發現，人 SKM-1 細胞中過表達Atg3，細胞凋亡率顯著增加。Atg3還可通過Atg12可與共價結合形成復合物，經線粒體途徑，引發細胞凋亡［16］。已有研究表明，抑制Beclin1等自噬相關因子的表達，可拮抗胰島 β細胞凋亡［17，18］。由此推測，在本研究中，西格列汀對 Atg3、Atg12及Beclin1的下調作用，與其抑制胰島β細胞凋亡的作用有關。

綜上所述，西格列汀治療改善了2型糖尿病小鼠的血糖調控，抑制了β細胞凋亡，增強了β細胞合成及分泌胰島素的能力;其對胰島β細胞自噬相關因子Atg3、Atg12及Beclin1的下調作用，可能是其改善胰島β細胞功能的新機制。本課題從全新的角度探究了西格列汀保護2型糖尿病胰島β細胞的機制，為該藥物的臨床應用提供了新的依據。

圖8 p53基因PCR擴增電泳圖(部分)及測序峰圖

圖9 兩組胰腺組織胰島素與胰高血糖素免疫熒光染色（×200）

圖10 兩組胰島β細胞Beclin1蛋白免疫組化染色（×400）

［1］Ohmura H，Mita T，Taneda Y，et al.Efficacy and safety of sitagliptin in Japanese patients with type 2 diabetes［J］.J Clin Med Res，2015，7(4):211-219.

［2］Otsuka Y，Yamaguchi S，Furukawa A，et al.Addition of sitagliptin or metformin to insulin monotherapy improves blood glucose control via different effects on insulin and glucagon secretion in hyperglycemic Japanese patients with type 2 diabetes［J］.Endocr J，2015，62(2):133-143.

［3］Zhang Y，Chen Y，Cheng J，et al.DPP Ⅳ inhibitor suppresses STZ-induced islets injury dependent on activation of the IGFR/Akt/mTOR signaling pathways by GLP-1 in monkeys［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，456(1):139-144.

［4］Mega C，Vala H，Rodrigues-Santos P，et al.Sitagliptin prevents aggravation of endocrine and exocrine pancreatic damage in the Zucker Diabetic Fatty rat-focus on amelioration of metabolic profile and tissue cytoprotective properties［J］.Diabetol Metab Syndr，2014，6(1):42.

［5］Zhao Y，Yang L，Xiang Y，et al.Dipeptidyl peptidase 4 inhibitor sitagliptin maintains β-cell function in patients with recent-onset latent autoimmune diabetes in adults:one year prospective study［J］.J Clin Endocrinol Metab，2014，99(5):E876-880.

［6］Masini M，Bugliani M，Lupi R，et al.Autophagy in human type 2diabetes pancreatic beta cells［J］.Diabetologia，2009，52(6):1083-1086.

［7］Takeda Y，Fujita Y，Honjo J，et al.Reduction of both beta cell death and alpha cell proliferation by dipeptidyl peptidase-4 inhibition in a streptozotocin-induced model of diabetes in mice［J］.Diabetologia，2012，55(2):404-412.

［8］Feng Y，He D，Yao Z，et al.The machinery of macroautophagy［J］.Cell Res，2014，24(1):24-41.

［9］Wirawan E，Lippens S，Vanden Berghe T，et al.Beclin1:a role in membrane dynamics and beyond［J］.Autophagy，2012，8(1):6-17.

［10］Wang W，Fan H，Zhou Y，et al.Knockdown of autophagy-related gene BECLIN1 promotes cell growth and inhibits apoptosis in the A549 human lung cancer cell line［J］.Mol Med Rep，2013，7(5):1501-1505.

［11］Decuypere JP，Parys JB，Bultynck G.Regulation of the autophagic bcl-2/beclin 1 interaction［J］.Cells，2012，1(3):284-312.

［12］Haller M，Hock AK，Giampazolias E，et al.Ubiquitination and proteasomal degradation of ATG12 regulates its proapoptotic activity［J］.Autophagy，2014，10(12):2269-2278.

［13］Rubinstein AD，Eisenstein M，Ber Y，et al.The autophagy protein Atg12 associates with antiapoptotic Bcl-2 family members to promote mitochondrial apoptosis［J］.Mol Cell，2011，44(5):698-709.

［14］Metlagel Z，Otomo C，Ohashi K，et al.Structural insights into E2-E3 interaction for LC3 lipidation［J］.Autophagy，2014，10(3):522-523.

［15］Wang L，Song J，Zhang J，et al.Lentiviral vector-mediate ATG3 overexpression inhibits growth and promotes apoptosis of human SKM-1 cells［J］.Mol Biol Rep，2014，41(4):2093-2099.

［16］Radoshevich L，Murrow L，Chen N，et al.ATG12 conjugation to ATG3 regulates mitochondrial homeostasis and cell death［J］.Cell，2010，142(4):590-600.

［17］Tanemura M，Ohmura Y，Deguchi T，et al.Rapamycin causes upregulation of autophagy and impairs islets function both in vitro and in vivo［J］.Am J Transplant，2012，12(1):102-114.

［18］曾建，陳曉軍.沙格列汀對改善2型糖尿病患者血壓的效果及其作用機制［J］.武警醫學，2015，26(1):44-46.