結核感染T細胞斑點試驗的臨床應用價值

劉　麗　劉曉民

結核感染T細胞斑點試驗的臨床應用價值

劉麗劉曉民

【關鍵詞】結核感染T細胞斑點試驗;結核;敏感性;特異性

在世界范圍內結核病是一種高發病率、高病死率的疾病，因此研究出一種新的檢查手段已迫在眉睫。結核感染T細胞斑點試驗(T cells spot test of tuberculosis infection, T-SPOT.TB)，是利用酶聯免疫斑點法檢測結核感染者體內的特異性T淋巴細胞來診斷結核的一種新方法，具有較高的敏感性及特異性，目前已在臨床上廣泛應用[1]。

一、T-SOPT.TB方法診斷結核感染的優點

摘要根據2013年世界衛生組織發布的《2013年全球結核病報告執行》顯示：2012年，據估算，全世界共有860萬人罹患結核病，130萬人死于結核病(其中包括32萬艾滋病毒陽性者)，因此結核病的診斷與治療是人類健康問題的焦點。傳統的結核檢查方法有胸部X線或肺縱隔CT，結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test ,TST)、痰抗酸桿菌涂片。胸部X線或肺縱隔CT實驗方法缺乏特異性，且絕大多數患者胸部X線表現不典型，故只能作為結核病診斷的參考。TST操作簡單、價格低廉，常用于臨床，但易受免疫狀況、交叉反應及接種卡介苗的影響，故敏感性及特異性較低。痰抗酸桿菌涂片臨床上常用于肺結核的診斷，其受制于痰液中分枝桿菌數量，故敏感性較低，且無法對肺外結核及不咯痰的肺結核作出診斷，也使其應用受到一定的制約[2]。T-SPOT.TB 試劑盒是由Oxford Immunotec公司研制，用酶聯免疫斑點技術檢測對早期分泌抗原靶 6KD(early secretory antigenic target-6, ESAT-6)和培養濾液蛋白10KD(culture filtrate protein-10, CFP-10)有反應的T細胞，達到診斷結核感染。該方法具有較高的敏感性及特異性。

二、T-SOPT.TB的原理及結果判斷

T-SPOT.TB 試劑盒2004年于歐洲上市，2008年，美國FDA完成對T-SPOT.TB的審批。2010年獲得我國 SFDA 審批。與QFT實驗不同，本實驗必須隔離外周血單個核細胞(peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)，而且為了保證實驗的嚴謹，在收集血液樣本后8 h內，必須隔離這些細胞。T-SPOT.TB是利用酶聯免疫斑點法檢測結核感染者體內的特異性T淋巴細胞來診斷結核的一種新方法，該方法源于Mahairas等在1996年發現的一段存在于致病性結核分枝桿菌中名為“RD1”的基因序列。該致病性結核菌所特有的基因片段即(RD1序列)僅在極少數的非結核桿菌內發現，該段基因編碼表達的蛋白(ESAT-6蛋白質和CFP-10蛋白質)為致病性結核桿菌所特有，BCG(卡介苗)中沒有發現存在此段基因。因此，曾經接種BCG的人不會因此發生免疫交叉反應而干擾實驗結果。RD1編碼產生的ESAT-6蛋白質和CFP-10蛋白質(culturefiltrate protein)作為特異性抗原刺激機體T淋巴細胞產生特異性的細胞因子γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)。機體受到致病性結核桿菌感染后，引發固有免疫和獲得性免疫。由于機體內長期存在特異性的中央型以及效應型記憶細胞，當實驗中加入的抗原(ESAT-6蛋白質和CFP-10蛋白質)再次刺激機體的T淋巴細胞時，這些記憶性T淋巴細胞可迅速活化增殖，并釋放γ干擾素。通過酶聯免疫斑點技術對γ干擾素的含量進行檢測從而對致病性結核桿菌的感染進行診斷。酶聯免疫斑點法檢測特異性T淋巴細胞篩查結核患者現已應用于歐美各國臨床結核診斷中，而在國內僅處于試驗性診斷階段。酶聯免疫斑點技術能夠檢測出1/100 000至1/50 000的PBMC中經抗原刺激后釋放細胞因子的細胞，目前已成為最敏感的檢測方法之一。

T-SOPT.TB的實驗結果清晰, 易于判斷。當測試孔A或B達到以下標準則判定為陽性結果:①陰性對照斑點數為0-5個,(A或B孔斑點數-陰性孔斑點數)≥6,判斷為陽性(+);②陰性對照斑點數≥6,A或B孔斑點數≥2倍陰性孔,判斷為陽性(+);若A、B孔斑點數不夠以上標準,且陽性對照反應良好,則為陰性(-)。若陰性對照孔斑點數超過10,陽性對照孔斑點數低于20時,結果不能確定。

三、T-SOPT.TB在結核病診斷中的應用價值

T-SOPT.TB在肺結核及肺外結核的診斷中都具有較高的敏感性及特異性。2005年Meier等[3]通過研究89例患者(其中65例被證實為肺結核，7例被證實肺外結核，5例非結核分支桿菌感染，12例非分支桿菌引起的肺部疾病)，72例結核病患者中(肺結核65例，肺外結核7例)，有70例患者T-SPOT.TB陽性，T-SPOT.TB的敏感性為97.2%。2010年 You等[4]對138例痰抗酸桿菌涂片陽性的患者中的63例行T-SPOT.TB檢查，其中有56例患者T-SPOT.TB陽性，證實T-SPOT.TB的敏感性為88.9%。 2011年 Wu 等[5]對31例結核和32例非結核的患者分別進行自制的ELISPOT和T-SPOT.TB對比分析，T-SPOT.TB的敏感性為77.4%，特異性為78.1%。 2011年Cruz等[6]通過對210例患者(其中13例兒童證實為結核病)研究證實T-SPOT.TB的敏感性為92%。2012年Turtle等[7]通過對64例患者研究證實T-SPOT.TB的敏感性為83.3%，特異性為75%。 2014年 Zhu等[8]通過對413例患者(其中包括163例肺結核，39例肺外結核，106例非結核分枝桿菌感染的患者，105例健康對照組)的分析，證實T-SPOT.TB的敏感性為85.64%，特異性為91.76%。2014年Kim等[9]通過對196例患者(41例患者為肺結核，93例非結核分枝桿菌感染的患者，62例健康人)的分析。41例肺結核患者中有36例患者T-SPOT.TB呈陽性，T-SPOT.TB的敏感性為87.8%，93例非結核分枝桿菌感染的患者中，41例患者T-SPOT.TB陰性，T-SPOT.TB的特異性為44.1%。健康人中有47例T-SPOT.TB陰性，T-SPOT.TB的特異性為75.8%。2014年Liu等[10]通過對1 084例患者分析(其中包括結核病384例，健康對照組700例)，384例患者中有331例T-SPOT.TB陽性，T-SPOT.TB的敏感性為86.2%(331/384)，700例健康對照組中638例T-SPOT.TB陰性，特異性為91.1%(638/700)。

四、T-SOPT.TB在特殊人群中的應用價值

T-SOPT.TB在HIV患者的診斷中仍然具有較高的敏感性和特異性。2013年Yu[11]等通過對131例HIV患者研究證實T-SPOT.TB的敏感性為41.3%，特異性為94.6%。而TST的敏感性為12.9% ，特異性為91.8%。T-SOPT.TB在HIV患者中結核病的診斷率明顯優于TST。T-SPOT.TB在免疫功能低下的患者中同樣具有很高的敏感性和特異性。2012年Junq[12]等通過對119例痰涂陰免疫力低下的肺結核患者分別進行TST、QFT-GIT、T-SPOT.TB檢測，TST的敏感性、特異性分別為41.2%，91.8%。QFT-GIT的敏感性、特異性分別為59%，61.3%。T-SPOT.TB的敏感性、特異性分別為72%，42.3%。2011年祁燕偉等[13]通過對81例HIV/AIDS患者合并肺結核的患者進行研究證實T-SPOT.TB的敏感性為79.01%，痰涂片的敏感性為49.38%。

五、T-SOPT.TB準確性的影響因素

Lee等[14]通過對 32例ITR患者(空白對照孔斑點超過10個，陽性質斑點數少于20個)的研究證實：T-SPOT.TB結果的準確性與患者年齡，基礎疾病，應用免疫抑制劑治療，淋巴細胞減少癥無關。Lee等[15]通過研究324例患者得出結論：T-SPOT.TB的假陰性率為17%，TST的假陰性率為54%。與TST相比，T-SPOT.TB不易產生假陰性結果。且臨床表現和免疫抑制對T-SPOT.TB的影響較小。Kim等[9]對196例患者T-SPOT.TB的假陽性多種因素分析得出結論：有結核感染病史的患者，X線上可見陳舊的結核纖維化疤痕的患者，年齡大的患者都會對T-SPOT.TB的結果產生干擾。T-SPOT.TB可以在未受污染的血液樣本里進行，使用T-Cell Xtend 試劑儲存過夜的血液樣本不影響T細胞試劑靈敏度的測定。<25 ℃儲存和運輸是絕對必要條件，而且，對于污染的紅細胞血樣，使用細胞自動計數器可以減少敏感性的降低[16]。

T-SOPT.TB具有較高的敏感性及特異性，對肺結核及肺外結核都具有一定的診斷價值。且不受年齡、基礎疾病、免疫缺陷的影響，能早期診斷結核感染，所需時間較短。但其不是確診和排除結核的“金標準”，且對陳舊性結核及活動性結核的診斷缺乏特異性，價格昂貴。作為臨床醫生，需具體分析患者的綜合情況，正確理解T-SOPT.TB，為臨床結核病的診斷和鑒別診斷提供幫助。開發出一項新的檢查方法能夠鑒別陳舊性結核病及活動性結核病已成為防治TB的新目標。

參考文獻

1石慧，崔麗英. 結核感染T細胞斑點試驗診斷結核性胸膜炎的應用價值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(2)： 195-199.

2張玉平, 丁顯平, 張麗媛, 等. T-SPOT.TB、痰涂片和TB-DNA檢測在肺結核診斷中的比較研究[J]. 成都醫學院學報, 2013, 8(1): 49-51.

3Meier T, Eulenbruch HP, Wrighton-Smith P, et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay(T-SPOT.TB) for diagnosis of tuberculosis in clinical practice[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2005, 24(8): 529-536.

4Han YM, Kim HS, Kim CH, et al. Analysis ofpatients with positive acid-fast bacilli culture and negative T-SPOT.TB results[J]. Korean J Lab Med, 2010, 30(4): 414-419.

5Wu X, Li Q, Liang Y, et al. Clinical evaluation of a homemade enzyme-linked immunospot assay for the diagnosis of active tuberculosis in China[J]. Mol Biotechnol, 2011, 47(1): 18-25.

6Cruz AT, Geltemeyer AM, Starke JR, et al. Comparing the tuberculin skin test and T-SPOT.TB blood test in children[J]. Pediatrics, 2011, 127(1): e31-e38.

7Turtle L, Kemp T, Davies GR, et al. In routine UK hospital practice T-SPOT.TB is useful in some patients with a modest pre-test probability of active tuberculosis[J]. Eur J Intern Med, 2012, 23(4): 363-367.

8Zhu C, Liu Z, Li Z, et al. The performance and limitation of T-SPOT.TB for the diagnosis of TB in a high prevalence setting[J]. J Thorac Dis, 2014, 6(6): 713-719.

9Kim CH, Kim JY, Hwang YI, et al. Interferon-γ enzyme-linked immunospot assay in patients with tuberculosis and healthy adults[J]. Tuberc Respir Dis(Seoul), 2014, 76(1): 23-29.

10Liu H, Huang Y, Wang J, et al. Clinical evaluation of T-SPOT. TB assay in 1 084 tuberculosis suspects[J]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi, 2014, 37(3): 192-196.

11Yu Y, Zhao X, Wang W, et al. Diagnostic performance of interferon-gamma releasing assay in HIV-infected patients in China[J]. PLoS One, 2013, 8(8): e70957.

12Junq JY, Lim JE, Lee HJ, et al. Questionable role of interferon-γ assays for smear-negative pulmonary TB in immunocompromised patients[J]. J Infect, 2012, 64(2): 188-196.

13祁燕偉, 白勁松, 萬榮, 等. T細胞斑點試驗在人類免疫缺陷病毒合并肺結核感染中不同T細胞水平臨床診斷價值[J]. 昆明醫學院學報, 2011, 32(9): 63-67.

14Lee YM, Kim SM, Park SJ, et al. Indeterminate T-SPOT.TB test results in patients with suspected extrapulmonary tuberculosis in routine clinical practice[J]. Infect Chemother, 2013, 45(1): 44-50.

15Lee YM , Park KH, Kim SM, et al. Risk factors for false-negative results of T-SPOT.TB and tuberculin skin test in extrapulmonary tuberculosis[J]. Infection, 2013, 41(6): 1089-1095.

16Talbot EA, Maro I, Ferguson K, et al. Maintenance of Sensitivity of the T-SPOT.TB Assay after Overnight Storage of Blood Samples, Dar es Salaam, Tanzania[J]. Tuberc Res Treat, 2012, 2012： 345290.

(本文編輯：黃紅稷)

劉麗，劉曉民. 結核感染T細胞斑點試驗的臨床應用價值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(3)： 388-389.

·綜述·

收稿日期：(2014-09-16)

文獻標識碼：中圖法分類號： R52 A

通訊作者：劉曉民，Email: neikexue@126.com

DOI：作者單位： 150000 哈爾濱醫科大學附屬第一醫院呼吸內科