絲切蛋白1及前纖維蛋白1在外陰鱗狀細胞癌中的表達及意義

崔守斌，姜英，武昕

（1.中國醫科大學附屬第一醫院婦科，沈陽110001；2.濱州醫學院煙臺附屬醫院婦產科，山東煙臺264100）

絲切蛋白1及前纖維蛋白1在外陰鱗狀細胞癌中的表達及意義

崔守斌1，2，姜英1，武昕1

（1.中國醫科大學附屬第一醫院婦科，沈陽110001；2.濱州醫學院煙臺附屬醫院婦產科，山東煙臺264100）

目的 探究絲切蛋白1（CFL1）及前纖維蛋白1（PFN1）在外陰鱗狀細胞癌（VSCC）中的表達與意義。方法采用免疫組化和免疫印跡方法檢測CFL1及PFN1在VSCC中的表達及其與臨床病理資料相關性。結果CFL1在VSCC中的表達顯著高于外陰的正常皮膚（P＜0.05）；臨床Ⅲ期的表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；在低分化、中分化的VSCC中的表達明顯高于高分化VSCC（P＜0.05）；伴淋巴結轉移的表達明顯高于無淋巴結轉移（P＜0.05）。PFN1在VSCC中的表達顯著高于外陰的正常皮膚（P＜0.05）；臨床Ⅲ期的表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；伴淋巴結轉移的表達明顯高于無淋巴結轉移（P＜0.05）；VSCC低、中分化和高分化之間沒有統計學差異（P＞0.05）。Pearson相關性分析結果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表達呈正相關（r2= 0.753，P＜0.001）。結論CFL1及PFN1的表達與VSCC的發生和發展有關。

絲切蛋白1；前纖維蛋白1；外陰鱗狀細胞癌；免疫組化；免疫印跡

外陰惡性腫瘤約90%以上為外陰鱗狀細胞癌（vulvar squamous cell carcinoma，VSCC），常見于60歲以上的絕經后婦女，其5年生存率為58.9%～68.9%，目前病因尚不十分清楚。

絲切蛋白1（cofilin-l，CFL1）作為絲切蛋白的2個亞型之一，是一種分子量約為21 kDa的肌動蛋白結合蛋白（actin binding protein，ABP），基因存在于染色體11q13上，正常表達于真核生物多種非肌肉組織，尤其是腦和肝中高表達，在調控細胞運動方面起重要作用［1］，目前研究發現CFL1在肺癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌［2］中呈高表達，與腫瘤的生長、遷移、侵襲密切相關［3］。前纖維蛋白1（profilin-1，PFN1）也被稱為細胞骨架蛋白結合蛋白1，也是ABP的一種，作為前纖維蛋白家族的一個成員，分子量約為12～15 kDa，基因定位于17p13.3，于真核生物細胞中普遍存在，參與調節肌動蛋白骨架重塑，細胞形態的維持、細胞黏附、運動、生長、分裂以及其配體依賴的信號轉導等多種生物學功能［4］。研究發現PFN1在一些癌中低表達，如乳腺癌、胰腺癌［5］、膀胱癌［6］、鼻咽癌、肝癌等，在另一些癌中高表達，如胃癌、腎癌［7］等。CFL1及PFN1在VSCC中表達如何，與VSCC發生發展是否有關尚不清楚。因此，本研究通過免疫組化法（SP法）和Western blot方法檢測CFL1及PFN1在VSCC中的表達情況，探討其與VSCC的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選自中國醫科大學第一附屬醫院2003年6月至2013年6月35例住院VSCC患者；外陰整形手術中去除正常外陰皮膚組織的20例患者，選取的組織用10%的甲醛固定，制成石蠟塊。搜集VSCC患者的臨床病理資料：年齡32～75歲，平均年齡（55.9±3.6）歲。根據1988 FIGO臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；分化程度：高分化19例，中分化10例，低分化6例；淋巴結轉移10例，無淋巴結轉移25例。

1.1.2 實驗試劑：小鼠抗人Cofilin-1單克隆抗體購自美國Proteintech公司，兔抗人單克隆Profilin-1抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruze公司。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）購自北京中山金橋公司，ECL試劑盒和BCA試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法檢測CFL1及PFN1蛋白的表達：石蠟切片常規脫蠟水化。3%H2O2常溫下孵育20 min，使內源性過氧化物酶滅活，后行抗原修復，常溫下羊血清孵育30 min，Cofilin-1（1∶100）及Profilin-1（1∶400）于4℃冰箱過夜，生物素標記山羊抗兔IgG室溫孵育15 min，室溫下S-A/HRP中孵育15 min，后DAB顯色劑顯色，最后蘇木素復染封片。以PBS代替一抗作為陰性對照片。結果判定：CFL1及PFN1均為細胞質和細胞核/細胞質著色，陽性染色為黃色或棕黃色顆粒。使用生物圖片處理系統Meta Morph進行平均光密度值測算。每張切片平均光密度值的測算，選擇高倍鏡下5個不同視覺區域，每個區域包括正常皮膚的表皮和部分真皮、癌組織的癌巢與間質，然后計算同一張切片的平均光密度值。

1.2.2 免疫印跡方法：取VSCC組織（10例）和正常外陰皮膚組織（10例），裂解液提取組織總蛋白，制好電泳凝膠后行SDS-PAGE電泳，蛋白電泳轉至聚偏二氟乙烯膜，其用5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗［CFL1（1∶100）；PFN1（1∶400）；β-actin（1∶1 000）］4℃過夜，次日加二抗［山羊抗兔（1∶5 000）；山羊抗小鼠（1∶5 000）］，常溫孵育2 h，ECL試劑盒顯影。用β-actin作為內參照物。用Quantity One軟件半定量分析特異性條帶的灰度值，與內參照的灰度值的比較值作為蛋白的相對含量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 CFL1在VSCC和外陰正常皮膚組織中的表達

CFL1陽性細胞表達于外陰正常表皮細胞全層，散在分布，呈細胞質和細胞核陽性（圖1A），陽性細胞的平均光密度值0.284 9±0.011 6；VSCC癌巢細胞中有陽性表達，其間質中也有表達（圖1B），陽性細胞的平均光密度值是0.341 0±0.012 0，2者有統計學差異（P=0.041）。

2.2 Profilin-1在VSCC和外陰正常皮膚組織中的表達

Profilin-1陽性細胞表達于外陰正常表皮近基底層和基底層，呈細胞質和細胞核陽性（圖2A），陽性細胞的平均光密度值0.150 6±0.008 9，VSCC癌巢細胞中有陽性表達，其間質中也有表達（圖2B），陽性細胞的平均光密度值是0.259 1±0.020 3，2者有統計學差異（P=0.028）。

2.3 CFL1與PFN1表達的相關性分析

相關性分析結果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表達呈正相關（r2=0.753，P＜0.001），見圖3。

2.4 Western blot法檢測CFL1與PFN1的表達

正常外陰皮膚中CFL1的平均灰度值比值（0.33±0.09）低于VSCC（0.99±0.03），2者比較有統計學差異（P=0.000）。正常外陰皮膚中PFN1的平均灰度值比值（0.88±0.14）低于VSCC（1.39±0.16），2者比較有統計學差異（P=0.000），見圖4。

2.5 CFL1及PFN1的表達與VSCC的臨床病理特點的關系

2.5.1 CFL1蛋白表達的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期與Ⅱ期，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）；中、低分化組高于高分化組，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）；有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組，兩者有統計學上的差異（P＜0.05）；年齡＜45歲與≥45歲患者比較無統計學差異（P＞0.05）。

2.5.2 PFN1蛋白表達的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期與Ⅱ期（P＜0.05）；中、低分化組略高于高分化組，但兩者無統計學差異（P＞0.05）；有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組（P＜0.05）；年齡＜45歲與≥45歲患者比較無統計學差異（P＞0.05），見表1。

3 討論

肌動蛋白結合蛋白作為一種調控肌動蛋白組裝和拆卸的蛋白質，在肌動蛋白聚合與解聚的動態平衡中起了至關重要作用，它們有保持細胞形態、介導細胞遷移等生物學功能，且同癌細胞的轉移和浸潤緊密相關［8］。近年研究表明腫瘤細胞侵襲、轉移與肌動蛋白結合蛋白介導的細胞骨架重組密切相關。肌動蛋白細胞骨架的組裝活躍是促進腫瘤細胞運動和遷移，誘發腫瘤發生侵襲及轉移的重要因素。

CFLl是真核細胞內的肌動蛋白結合蛋白中的一種，可改變肌動蛋白微絲結構，是肌動蛋白細胞骨架重構的重要調節因子。它的基本功能是連接纖維狀肌動蛋白微絲（F-actin），使F-actin解聚，同時中止單體球狀肌動蛋白微絲（G-actin）的匯集，進而增進了肌動蛋白的轉變，這種機制可能和細胞偽足形成有關。Ghosh等［3］通過實驗證明激活CFLl能誘導癌細胞的片狀偽足生成，且能引導細胞移動的趨勢，最終促進惡性細胞的遷移和侵襲。Yamaguchi等［9，10］通過實驗用siRNA沉默CFL1基因表達后，腫瘤細胞中CFLl表達下調，進而抑制腫瘤細胞偽足的裝配和穩定性，最終阻止細胞運動和腫瘤的侵襲。Yap等［11］研究表明在人腦膠質瘤的研究中CFLl水平和運動速率之間存在正相關，適量增加CFLl表達可以增加細胞的移行速度，而抑制CFLl的表達可降低癌細胞的遷移速率及侵襲性。同時，發現CFNl的過表達以濃度依賴的方式促進膠質母細胞瘤腫瘤細胞的運動，導致了腫瘤的侵襲，這些都提示CFNl的表達與腫瘤細胞侵襲、轉移有關。關于CFLl的活性調節，Polachini等發現CFLl活性主要受磷酸化/去磷酸化因素的調節，由于CFNl N末端絲氨酸-3（serine-3，Ser-3）位點的磷酸化，導致CFLl滅活，進而抑制其F-actin的解聚功能，當這一位點再次去磷酸化后又可使CFLl對F-actin的解聚活性復活，此兩種形式的交替協調控制肌動蛋白的聚合和解聚，從而影響細胞的遷移，細胞收縮等［12，13］。目前這種現象在口腔癌及卵巢癌中均已發現，Polachini等［13］研究證實CFLl的表達下調抑制口腔癌細胞侵襲。Zhou等［14］研究證實CFLl的表達上調可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，導致卵巢癌的發展。在VSCC中，我們的研究發現CFNl高表達，且隨著細胞分化程度降低、臨床分期增高及有淋巴結轉移CFLl表達增加，進一步提示CFLl在VSCC中促進了腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移，與VSCC的惡性進展呈正相關。

PFN1作為細胞微絲蛋白調節因子，在保持單體微絲蛋白和纖維狀微絲之間動態平衡上發揮關鍵作用，它通過結合肌動蛋白，調整細胞骨架的重構，引發細胞運動。此外于細胞增殖和凋亡的過程中也起著重要的調節作用［15］。目前發現PFN1在一些腫瘤中低表達，如乳腺癌、胰腺癌。Zou等［16，17］研究表明PFN1可抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖，其機制為PFN1表達可上調PTEN基因，從而抑制AKT通路，繼而引起p27蛋白增加，然后p27和cyclin E/ Cdk2復合體相連結使細胞周期停滯在G1期，最終抑制細胞增殖。Yao等［5］研究證實在胰腺癌細胞中，PFN1通過SIRT3-HIF1α機制促進細胞凋亡。因此認為PFN1可能是一個腫瘤抑制因子。但PFN1在另一些腫瘤中高表達，Zou等［16］在乳腺癌細胞系中研究發現PFN1的過表達可誘導MDA-MB-231的上皮間質轉化，其機制是PFN1和肌動蛋白之間的相互作用誘導單體微絲蛋白和纖維狀微絲之間失衡，進而影響肌動蛋白聚合；同時PFN1的過表達也增加了R-鈣黏蛋白的表達，R-鈣黏蛋白也可促進MDA -231細胞向上皮間質轉化，增進腫瘤細胞的遷移、侵襲［7］。我們的研究顯示PFN1在VSCC中高表達，且隨著臨床分期增高及有淋巴結轉移，PFN1表達增加，而與細胞分化程度無關，進一步提示PFN1在VSCC中可能具有促進上皮間質轉化作用，增加腫瘤細胞侵襲、轉移的能力，而在細胞分化、增殖方面未起作用。

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（編輯 武玉欣）

Cofilin-1 and Profilin-1 Expression in Vulvar Squamous Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

CUI Shou-bin1，2，JIANG Ying1，WU Xin1
（1.Department of Gynecology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，The Yantai Affiliated Hospital，Binzhou Medical College，Yantai264100，China）

ObjectiveTo investigate the expression of cofilin-1 and profilin-1 in vulvar squamous cell carcinoma（VSCC）and its significance.MethodsImmunohistochemic staining and Western blot were conducted to study the expression of cofilin-1 and profilin-1 in VSCC and its relationship with the clinicopathologic data.ResultsCofilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in those poorly and moderately differentiated VSCC than in those highly differentiated ones（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Profilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression had no statistically significant differences between the poorly and moderately differentiated VSCC and the highly differentiated ones（P＞0.05）.The Pearson correlation analysis showed that cofilin-1 and profilin-1 expression was positively correlated in vulva squamous cell carcinoma（r2=0.753，P＜0.001）.ConclusionCofilin-1 and profilin-1 expression associates with the emergence and development of VSCC.

cofilin-1；profilin-1；vulvar squamous cell carcinoma；immunohistochemistry；Western blot

R737.35

A

0258-4646（2015）01-0010-05

國家自然科學基金（30973190）；沈陽市科學技術計劃項目（F11-264-1-39）

崔守斌（1982-），男，醫師，碩士.

武昕，E-mail：xinwu.1964@aliyun.com

2014-10-04

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