川芎嗪對大鼠脊髓損傷后運動功能恢復的影響及機制

張男，趙茗，孫亞澎

（河北醫科大學第三醫院脊柱外科，石家莊050051）

川芎嗪對大鼠脊髓損傷后運動功能恢復的影響及機制

張男，趙茗，孫亞澎

（河北醫科大學第三醫院脊柱外科，石家莊050051）

目的 探討川芎嗪對大鼠脊髓損傷（SCI）后運動功能恢復的影響及可能的機制。方法健康成年Sprague-Dawley大鼠60只，隨機分為川芎嗪治療組（TMP組）、單純脊髓損傷組（SCI組）和假手術組（Sham組），每組20只。Sham組只暴露脊髓，不打擊。SCI組和TMP組采用Allen法損傷大鼠T9脊髓節段，復制SCI動物模型。造模成功后30 min，TMP組腹腔注射川芎嗪200 mg/kg，每日1次，共7次；SCI組和Sham組腹腔注射等體積的生理鹽水。于術后1、3、7、14 d隨機抽取各組動物5只，進行后肢功能Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分、脊髓組織HE染色、脊髓組織中白細胞介素（IL）17和磷酸化的信號轉導與轉錄激活因子3（pSTAT3）表達水平的檢測。結果與Sham組相比，SCI組術后各時間點BBB評分均顯著降低，形態學出現典型的SCI改變，脊髓組織中IL-17和pSTAT3表達水平顯著升高（P＜0.05）。與SCI組相比，TMP組術后3、7、14 d BBB評分均顯著升高，SCI改變減輕，脊髓組織中IL-17和pSTAT3表達水平顯著降低（P＜0.05）。結論川芎嗪可通過抑制STAT3活性降低IL-17水平，促進SCI大鼠運動功能的恢復。

脊髓損傷；川芎嗪；大鼠；運動功能；白細胞介素17；磷酸化的信號轉導與轉錄激活因子3

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴重的中樞神經系統創傷，導致損傷部位以下運動和感覺功能障礙［1］。SCI嚴重的病理后果和高昂的治療費用給患者帶來極大的痛苦，同時也成為巨大的社會醫療負擔。但是目前尚無治愈SCI的醫療措施，因此SCI的修復和康復治療研究具有重要的臨床意義。SCI的病理生理學過程包括初始的原發性損傷以及由此引發的繼發性損傷。原發性SCI是脊髓組織遭受外力損傷后瞬間引起的組織損壞，是不可逆性損傷。損傷后在原發性損傷的基礎上因多種因素參與而引發的脊髓組織進行性、自毀性級聯放大的破壞過程稱為繼發性SCI，其損害程度遠遠超過了原發性SCI［2］。因此，研究繼發性SCI的發生機制，在預防和逆轉繼發性SCI以及最大程度地保留殘存的脊髓功能及促進損傷脊髓結構和功能重建具有重要意義。白細胞介素（interleukin，IL）17是最近新發現的具有強致炎性作用的細胞因子，主要來源于CD4+T細胞亞群中的T輔助細胞17（T helper 17，Th17）細胞。而信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的異常激活能夠調控Th17細胞的分化，促進IL-17的分泌［3］。近來研究發現，STAT3及其調節的IL-17表達參與繼發性SCI的發生和發展［4，5］。

川芎嗪具有離子通道阻斷、抗炎、抗氧化、抗凋亡等廣泛的生理藥理學作用［6，7］。多項研究證實川芎嗪可促進SCI后運動功能恢復［8～10］，但確切的機制還不清楚。川芎嗪能否通過抑制STAT3活性減少IL-17的表達、促進SCI后運動功能恢復未見報道。本研究通過測定TMP處理的SCI大鼠模型脊髓中炎性因子IL-17、pSTAT3表達水平，觀察脊髓組織形態學變化及評價后肢運動功能的方法，研究川芎嗪對SCI后大鼠運動功能恢復的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級成年健康Sprague-Dawley大鼠60只，雌雄不限，體質量（250±20）g，購自河北醫科大學實驗動物部。將60只大鼠隨機分為川芎嗪治療組（TMP組）、單純脊髓損傷組（SCI組）和假手術組（Sham組），每組20只。

1.2 主要試劑和儀器

IL-17兔單克隆抗體和pSTAT3兔單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術公司。全自動酶標儀和電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Dounce勻漿器購自美國Wheaten公司；-80℃超低溫冰箱購自美國Thermo公司；高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。

1.3 模型制備

戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于手術臺上，初步定位T9棘突位置。背部正中剃毛，暴露皮膚，常規消毒鋪無菌洞巾后，切開大鼠的皮膚，刀柄分離棘突兩側肌肉，暴露棘突及椎弓板，咬骨鉗咬除棘突及椎板，暴露脊髓，保證硬脊膜完整。參照Allen′s方法制作簡易打擊模型：由不銹鋼材料制成，擊打棍直徑4.0 mm，打擊頭呈凸形，質量20 g，擊打棍套管內直徑4.1 mm，打擊高度為2.5 cm，以出現脊髓充血、雙下肢痙攣抖動、尾巴痙攣性擺動視為造模成功。打擊完畢，逐層縫合肌肉和皮膚。并立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液9 mL/kg以補液。待動物清醒后放回飼養籠中單籠飼養。術后3 d內，每天腹腔注射8×104U青霉素鈉以防感染。術后大鼠可自由飲水、進食，飼養環境中須保持適宜的溫度和濕度，定時清潔籠具，并保持大鼠身體干燥，每天擠壓膀胱排尿3次，至大鼠恢復自主排尿。

1.4 治療方法

TMP組：造模成功后30 min腹腔注射川芎嗪200 mg/kg，此后每天按相同劑量注射1次，共7次。SCI組和Sham組：造模成功后腹腔注射等體積生理鹽水。

1.5 評定方法

術后1、3、7、14 d分別從各組隨機抽取5只大鼠進行評分和相關測定。

1.5.1 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分：評分標準：第1步（0～7分）評判動物后肢各關節活動；第2步（8～13分）評判動物后肢的步態和協調功能；第3步（14～21分）評估動物運動時爪子的精細運動；3項滿分21分。采用雙盲法，每次評分由經培訓后的兩人分別獨立完成，左右兩側分別評分后取平均值作為最后評分。

1.5.2 HE染色：每個時間點每只大鼠隨機選取2張切片進行HE染色，損傷嚴重段脊髓取視野，光鏡下觀察脊髓組織形態學變化。

1.5.3 Western blot：收集脊髓組織并提取蛋白，上樣蛋白30 μg，電泳（10%SDS-PAGE凝膠），轉印（80 V，120 min），5%正常小牛血清封閉，抗pSTAT3（1∶10 000，美國Abcam公司）、抗IL-17（1∶1 000，美國Abcam公司）和抗β-actin（1∶1 000，美國Abcam公司），4℃孵育過夜，分別與各自對應的二抗（北京中杉）室溫孵育2 h，加ECL顯色劑（北京中杉）1 min，X線膠片曝光成像。結果經自動電泳凝膠成像分析儀（Chemi Image 5500，美國Alpha Innotech）采集，進行灰度值分析。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

Sham組術后如正常大鼠，SCI組及TMP組大鼠的術后情況基本一致，打擊后大鼠均表現為身體痙攣性顫動，尾巴痙攣性擺動，雙下肢及軀體回縮樣撲動。麻醉蘇醒后大鼠雙下肢呈弛緩性癱瘓，可出現尿潴留或尿失禁。術后3 d大鼠開始少量活動，進食少，尿潴留較嚴重，部分動物伴有血尿及腹部脹氣癥狀。此后飲食及活動逐漸增加。大鼠傷口未見感染，身體未出現壓瘡；經人工按摩膀胱5～7 d后，所有大鼠基本能夠恢復自主排尿。

2.2 運動功能的判定結果

采用BBB評分方法對大鼠SCI后1、3、7及14 d的后肢運動功能進行評估，見圖1。Sham組大鼠術后功能完全恢復；SCI組和TMP組后肢的運動功能均有所改善，TMP組改善更顯著，術后3、7、14 d SCI組和TMP組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 脊髓組織形態學觀察結果

如圖2所示，Sham組神經細胞及神經膠質細胞形態規則，白質致密，胞膜、核膜清晰，胞核大而圓，位于細胞中央，核染色質少，呈淡藍色，核中央有一清楚核仁，胞質呈淡紅色。SCI組出現典型的損傷改變，表現為炎性細胞增多，神經元水腫、變形，空泡形成。TMP組SCI明顯減輕。

2.4 脊髓組織中IL-17和pSTAT3表達水平的變化

如圖3所示，Sham組IL-17和pSTAT3表達各時間點基本無變化。SCI組損傷后1、3、7及14 d IL-17和pSTAT3表達均出現不同程度升高，與Sham組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。TMP組術后3、7、14 d IL-17和pSTAT3表達均明顯低于SCI組（P＜0.05）。

3 討論

川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一，屬酰胺類生物堿，化學結構為四甲基吡嗪，有抗腫瘤血管生成、抑制血管內皮細胞的增殖、抗血小板聚集和抗炎等作用，目前已廣泛應用于臨床。近來研究證實川芎嗪可改善SCI后的神經功能的恢復［8～10］。本研究發現川芎嗪可顯著提高SCI大鼠BBB評分，改善SCI后的病理改變，這與以往的報道一致［8～10］。

損傷后局部免疫炎性反應是繼發性SCI主要機制［11］。SCI后缺血壞死的神經元、膠質細胞及內皮細胞均可產生大量炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子α、IL-1β、IL-18、IL-10等［12］。它們可刺激其他細胞因子和炎性介質的產生，影響神經膠質細胞的基因表達。這些細胞因子可作為內皮細胞活化的信號分子，從而刺激細胞黏附分子的分泌及白細胞與內皮細胞之間的黏附，這樣將會誘導白細胞向損傷區的浸潤，進一步加重SCI。

IL-17是最近新發現的具有強效致炎作用的細胞因子，主要來源于CD4+T細胞亞群中的Th17細胞，與多種感染性疾病、自身免疫性疾病及炎性反應的發生發展過程有著密切的聯系，近幾年來成為各個領域的研究熱點。大量研究證明，IL-17的主要生物學效應是促進炎性反應，還可以同腫瘤壞死因子α等協同作用，加大、加強其致炎效應［13］，同時發現IL-17還參與中性粒細胞、樹突狀細胞的增殖、成熟以及趨化過程［14］。STAT3是一種重要的核轉錄因子，pSTAT3進入核后發揮重要功能，調節大量的基因表達。近年來研究報道，在Th17細胞分化過程中，IL-6、IL-21、IL-23及轉化生長因子β等多種細胞因子共同作用下，STAT3轉化為pSTAT3并形成二聚體進入細胞核，與IL-17啟動子直接結合并且調節其轉錄，進一步促進Th17細胞的分化［15］。本研究發現，SCI組損傷后1、3、7及14 d IL-17表達水平均出現不同程度升高，TMP處理后IL-17表達水平明顯降低。這提示SCI后IL-17大量產生，激活全身炎性反應。川芎嗪可抑制IL-17產生，從而減輕SCI后的炎性反應。進一步檢測pSTAT3發現，SCI組損傷后1、3、7及14 d pSTAT3水平均出現不同程度升高，TMP處理后pSTAT3水平明顯降低。提示川芎嗪可能通過抑制STAT3磷酸化抑制IL-17產生，從而減輕SCI后的炎性反應，發揮促進SCI恢復作用。

本研究結果證明，川芎嗪對SCI后動物運動功能恢復的促進作用與其抑制STAT3磷酸化及IL-17表達作用有關，這為川芎嗪在SCI治療的臨床應用提供了一定的理論基礎，但其促進脊髓功能恢復的具體機制還有待于進一步研究。

［1］張華，白金柱.脊髓損傷后皮質脊髓束的相關研究進展［J］.中國康復理論與實踐，2013，19（4）：349-353.

［2］Baptiste DC，Fehlings MG.Pharmacological approaches to repair the injured spinal cord［J］.J Neurotrauma，2006，23（3-4）：318-334.

［3］Su X，Ye J，Hsueh EC，et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells［J］.J Immunol，2010，184（3）：1630-1641.

［4］宗少暉，曾高峰，方曄，等.大鼠脊髓損傷模型Th17細胞分化中信號轉導與轉錄激活因子3的作用［J］.廣東醫學，2014，35（6）：812-815.

［5］宗少暉，曾高峰，方曄，等.基于STAT3信號通路研究IL-17在大鼠急性脊髓損傷模型中的作用研究［J］.2014，22（8）：742-745.

［6］納鑫，汪雪蘭，皮榮標.川芎嗪對中樞神經系統的藥理作用及其機制的研究進展［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19（1）：77-80.

［7］趙潤英，郝偉，孟祥軍，等.阿魏酸川芎嗪后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響［J］.中國醫科大學學報，2012，41（11）：1018-1021.

［8］嚴根福，王健，賈玉柱，等.川芎嗪對急性脊髓損傷大鼠神經細胞早期凋亡的影響［J］.浙江中醫雜志，2012，47（9）：666-668.

［9］王健，賈玉柱，鄭純威，等.川芎嗪對急性脊髓損傷大鼠神經細胞早期凋亡和Caspase-3 mRNA表達的影響［J］.中華中醫藥學刊，2011，29（2）：2662-2668.

［10］Hu JZ，Huang JH，Xiao ZM，et al.Tetramethylpyrazine accelerates the function recovery of traumatic spinal cord in rat model by attenuating inflammation［J］.J Neurol Sci，2013，324（1-2）：94-99.

［11］Schwartz M，Lazarov-Spiegler O，Rapalino O，et al.Potential repair of rat spinal cord injuries using stimulated homologous macrophages［J］.Neurosurgery，1999，44（5）：1041-1045.

［12］Popovich PG，Wei P，Stokes BT.Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats［J］.J Comp Neurol，1997，377（3）：443-464.

［13］McAllister F，Henry A，Kreindler JL，et al.Role of IL-17A，IL-17F，and the IL-17 receptor in regulating growth-related oncogene-alpha and granulocyte colony stimulating factor in bronchial epithelium：implications for airway inflammation in cystic fibrosis［J］.J Immunol，2005，175（1）：404-412.

［14］Steinman L.A brief history of T（H）17，the first major revision in the T（H）1/T（H）2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage［J］.Nat Med，2007，13（2）：139-145.

［15］Kortylewski M，Xin H，Kujawski M，et al.Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment［J］.Cancer Cell，2009，15（2）：114-123.

（編輯 陳 姜）

Effect and Mechanism of Tetramethylpyrazine on Motor Function after Spinal Cord Injury in Rats

ZHANG Nan，ZHAO Ming，SUN Ya-peng
（Department of Spine Surgery，The Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveTo observe the effect and mechanism of tetramethylpyrazine（TMP）on motor function after spinal cord injury（SCI）in rats.MethodsTotally 60 healthy adult Sprague-Dawley rats were divided randomly into TMP group，Sham group and SCI group with 20 rats in each group.The Sham group was only exposed spinal cord without imposing any harm.SCI group and TMP group were treated with Allen′s mode at the level of the 9th thoracic vertebra to imitate spinal cord injured animal models.30 min after SCI model was made，TMP group was given 200 mg/kg TMP daily for 7 times by intraperitoneal injection，while SCI group and Sham group were given an equal volume of normal saline daily.On the 1st，3rd，7th and 14th days after SCI，5 rats were selected randomly from each group.The motor function was assessed by Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）scale.The pathological changes of spinal cord tissue were determined by HE staining.The interleukin 17（IL-17）and phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3（pSTAT3）expression were determined by Western blot.ResultsCompared to Sham group，the BBB scores in SCI group were significantly increased，HE staining presented typical pathological changes of spinal cord injury in SCI group，meanwhile the expression of IL-17 and pSTAT3 in the spinal cord tissue in SCI group were all significantly increased（P＜0.05）.Compared to SCI group，BBB scores in TMP group were significantly increased on the 3rd，7th and 14th days after SCI，the pathological changes of spinal cord injury in TMP group was alleviated on the 3rd，7th and 14th days after SCI，the expression of IL-17 and pSTAT3 in TMP group were reduced on the 3rd，7th and 14th days（P＜0.05）.ConclusionTMP may reduce the expression of IL-17 by inhibiting the activity of STAT3 and promote the recovery of the motor function in rats after SCI.

spinal cord injury；tetramethylpyrazine；rats；motor function；interleukin 17；phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3

R651.2

A

0258-4646（2015）01-0060-04

張男（1983-），男，主治醫師，博士. E-mail：William.nan@163.com

2014-10-12

網絡出版時間：