微器官培養技術及其在前列腺癌研究中的應用

江 明黃月皎程 純. 南通大學醫學院基礎醫學研究室（南通 600）;. 南通大學附屬腫瘤醫院腫瘤內科; . 南通大學醫學院免疫學系

·專家述評·

微器官培養技術及其在前列腺癌研究中的應用

江 明1黃月皎2程 純3
1. 南通大學醫學院基礎醫學研究室（南通 226001）;
2. 南通大學附屬腫瘤醫院腫瘤內科; 3. 南通大學醫學院免疫學系

前列腺癌（prostate cancer, PCa）居西方國家男性中發生率的首位，也是第二癌癥致死原因[1]。導致前列腺癌致死的主要臨床原因是前列腺癌容易發生骨轉移，骨轉移的發生率占所有前列腺癌患者的80%以上[2, 3]。已有研究表明，前列腺癌骨轉移與腫瘤細胞與微環境（microenvironment）的相互作用有關，骨組織的微環境富含細胞因子、生長因子、祖細胞和造血細胞等，組成了適合前列腺癌細胞轉移的微環境，促進了腫瘤細胞的黏附、增殖、遷移以及存活[4]。最近5年來的研究已經證明，各種基因突變類型的前列腺癌具有一些共同的特征，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的前列腺癌治療藥物也有了空前的發展。但是，關于前列腺癌基因突變的分子機制尚不明確，其相對應的有效治療反應還不清楚。由于前列腺癌永生化細胞系很有限，尚不能很好地代表臨床疾病的多樣性，導致了體外研究模型的不足。由于前列腺癌組織建系困難，導致目前在現有公共細胞庫中前列腺癌細胞系較少[5]。近年來陸續有關于前列腺癌體外微器官培養（organoid culture）新技術的報道，該突破性技術可應用于各種臨床表型的前列腺癌樣本進行腫瘤生物學特征和其與腫瘤微環境相互作用等研究以及臨床抗癌藥物篩選，實現個體化腫瘤治療[6]。

一、腫瘤微器官培養技術的發展

在過去的30多年中，體外腫瘤模型的研究大多數是以單層二維腫瘤細胞培養的方式進行[7, 8]，很少是在三維模式中生長和形成組織器官樣結構進行研究，其結果導致了與原發腫瘤組織存在結構和生物學特性方面的差異，所以不能夠完全代表原發腫瘤的特點。微器官培養是在體外將器官和組織碎片擴增形成穩定的微結構并具有基本功能，而這一過程僅需幾天時間[9]。在90年代，有報道關于一些腫瘤，比如肺和咽喉部腫瘤在體外微器官培養條件的研究[10]；近幾年來相繼有報道小腸、結直腸、胰腺、胃以及肝臟等組織在體外微器官培養條件的研究[11-14]。Karthaus等優化了人正常前列腺組織基底細胞和腺上皮細胞的體外微器官培養條件[15]；使用上述前列腺組織體外培養的特定條件，Gao等成功地建立了新型前列腺癌細胞株，保留了7種來自不同疾病發展階段的人前列腺癌細胞系詳細的分子表型，其中也包括循環腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC），這些新型細胞株可用于體內外的各種藥物試驗[16]。Karthaus等研究發現一種依賴于R-spondin1的微器官培養方法，能夠使人或鼠的前列腺上皮細胞在體外長期增殖，因為前列腺基底細胞和腺上皮細胞均包含多潛能干細胞，在體外與大鼠泌尿生殖竇間充質（urogenital sinus mesenchyme, UGM）組織重組（tissue recombination）培養模型中，可使前列腺體組織再生和分化并保留完整的生物學特征，表明微器官培養技術在前列腺組織再生和前列腺癌發生、發展進程分子機制的研究中具有較好的應用價值[15]。

二、前列腺癌微器官培養技術

（一）細胞來源

應用于前列腺癌微器官培養的細胞來源不局限于已建立的細胞系，還可以是人和鼠前列腺組織的原代培養細胞、小鼠移植性前列腺癌細胞和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS）等。美國西奈醫學中心應用人前列腺癌細胞株LNCaP和其對應的RANK基因敲減LNCaPRANKL和LNCaPNeo亞型細胞等進行研究[4, 17]；在Karthaus等成功原代培養人正常前列腺基底細胞和腺上皮細胞的基礎上，Gao等運用微器官培養技術培養人類公共細胞庫中包括循環腫瘤細胞在內的7株前列腺癌細胞系，這些細胞系包含了SPOP基因突變、PTEN基因丟失、TMPRSS2-ERG基因融合以及包含TP53、PIK3R1、FOXA1基因突變和多種染色質修飾改變的去勢治療無效的前列腺癌細胞系[16]。對前列腺癌病人組織樣本原代培養，一般挑選具有特征性臨床表現和預后的活檢或手術新鮮樣本。通過切取原發和小鼠移植的新鮮腫瘤組織，用含有四乙酸二氨基乙烷（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）的胰酶消化，然后收集原代細胞進行下一步的微器官培養[18, 19]。在小鼠前列腺微器官培養中，通常應用流式細胞儀將表達CD49f的基底細胞和表達CD24的腺上皮細胞進行分選；而在培養人前列腺組織時，常用CD49f標記基底細胞，用CD26或CD29標記腺上皮細胞來進行分選[4, 15]。iPS細胞具有分化潛能，可以分化形成各種細胞類型，其微器官結構形成的兩個關鍵事件：嚴格的細胞挑選和保證細胞體系的一致性[20]。

（二）培養條件

進行小鼠前列腺癌微器官培養時，先將小鼠前列腺上皮組織降解，再混入特定細胞培養基質Matrigel，在其中增加常規的微器官培養介質，包含表皮生長因子（EGF）、Niggin和R-spondin1 （ENR）等[13]。Niggin為BMP抑制劑，在微器官形成的初期能明顯地增加微器官的數目，并參與微器官的擴增；R-spondin1為Wnt信號通路抑制劑，在前列腺發育過程中，主要在泌尿生殖竇中表達，與前列腺細胞的增殖密切相關[21]；還可加入Alk3/4/5的抑制劑A83-01，可抑制TGF-β信號通路，防止中斷前列腺細胞的增殖[22, 23]；通常還加入二氫睪酮（DHT），雖然不是必要的營養物質，但能明顯增加微器官形成的效率[15]。根據Jung等的前期研究結果，在人前列腺組織微器官培養時需要在培養基質Matrigel中加入各種生長因子，如成纖維細胞生長因子2和10 （FGF2，GF10）及前列腺素E2（PGE2）， 這些生長因子已經證實有助于前列腺細胞系的增殖[24, 25]。在小鼠前列腺微器官培養中可加入的介質成分，即ENR、A83-01和DHT等[14]；Karthaus等在此基礎上還加入了小腸微器官培養中的必需物質：尼克酰胺或稱煙酰胺及p38抑制劑SB202190等[15]。

（三）培養結果

研究發現，前列腺多能干細胞和腺上皮細胞形成微器官的能力有明顯的差別，多能干細胞相對于腺上皮細胞具有明顯的高效率[26]。正常野生型小鼠和人體前列腺提取的多能干細胞，經過約一周的培養，單一的細胞可形成實體細胞團簇，在2～3周之內，形成顯微鏡下可見的微器官腺體結構，經免疫組化、免疫熒光等分析顯示，形成的微器官結構由特異性表達CK5的基底細胞和表達CK8的腺上皮細胞共同組成[15]， 它們也分別特征性地表達其他一些基底細胞和腺上皮細胞的免疫標記，如p63、PSA、雄激素受體（androgen receptor，AR）等[6, 15]。

三、前列腺癌微器官培養技術的應用研究

（一）基因突變和表達譜檢測

由于體外建立前列腺癌細胞株非常困難，導致缺少具有代表性的前列腺癌細胞系模型。人類公共細胞系庫中前列腺癌細胞系較少，不能代表臨床疾病譜，所以迫切需要建立新的具有臨床表型共性的細胞系和模型以推動這一研究領域的進展。正常組織體細胞的培養在衰老之前僅僅經歷數量有限的生物學信號通路，這個現象被稱之為“海弗利克極限（Hayflick limit）”[27]。使用人工方法永生化細胞，可以恢復端粒酶的作用以突破這一限制，并活化p53和RB腫瘤抑制基因等信號通路[28]。最近，Clevers等發現在微器官培養體系中，正常人和小鼠的前列腺上皮細胞能被非永生化地無限期地培養[15]。這個體系已經被充分用于人轉移性前列腺癌的培養，并且已經成功建立幾個新的細胞系，這些細胞系能更加完整地代表臨床疾病的表型[16]。

研究證實，Lgr5是Wnt通路的競爭性拮抗劑R-spondin的受體，在鼠和人的多種成熟器官中作為干細胞的標記，在R-spondin依賴的微器官培養體系中，那些Lgr5標記的干細胞能夠分化并生長形成上皮樣結構，仍然保持與原始器官組織基因表達的一致性[29]。近期發表的應用Matrigel作為培養基質和增加培養介質來研究良惡性前列腺微器官培養體系，其技術的關鍵突破點是該體系的培養介質能使良性和惡性的前列腺細胞無限地繁殖，而不需要人工轉化，保持基因組圖譜沒有漂移，具有較高的建系成功率[15]。已建立的前列腺癌細胞系表達疾病特異性的基因突變，如ETS異位、SPOP突變、FOXA1突變和CHD1缺失等，其在該體外微器官培養模型體系中得以擴增[16]，對這些細胞系的持續培養和收集，可以發現更多的前列腺癌基因突變。

（二）腫瘤生物學行為研究

研究表明腫瘤細胞生物學行為受到周圍微環境的強烈影響，尤其是受到支持組織和間質（即腫瘤微環境）的影響。不同類型支持細胞間復雜的相互作用影響正常和惡性細胞的增值、分化和新陳代謝等一系列生物學行為特性[30]。不同病人的腫瘤細胞在相同的原代培養條件下，可出現不同的生長形態和形態學表現，具有侵襲性生長方式的細胞，通常預示著該病人不良的預后[31]。Ranga等報道了利用上皮來源的腫瘤細胞在體外三維培養，可方便地應用于分析腫瘤侵襲、遷移和腫瘤血管生成的生物學特性[32]。已有三維培養實驗結果表明，AR通過細胞與細胞外基質的相互作用進行調節；AR與整合素α2之間存在正反饋調節；前列腺癌細胞的增殖和存活依賴于p-Akt和p-FAK信號通路活化[4]。更改腫瘤細胞Matrigel微器官培養的條件，即改變細胞外基質中的組成部分，可應用于研究周圍微環境的組成成分對腫瘤生物學行為的影響[33]。三維微血管培養的研究顯示，幾種血管生成抑制劑，如：激酶抑制劑和單克隆抗體等對其敏感；建立腫瘤細胞分泌血管生成素的三維培養模型，可使前列腺癌細胞在缺乏外源性生長因子的情況下繼續生長[34]。

（三）藥物實驗

研究發現，傳統的用于藥物篩選的二維細胞培養模式被證明在藥物濃度、體內復雜微環境的相互作用和實驗結果的臨床應用可靠性等方面存在著許多明顯的缺點[30]。前列腺癌微器官培養技術可以初步解決這些問題，在一個富含生物性和相關物質的復合物的培養系統中，均一地和可擴增地培養大量前列腺癌細胞系，可應用于藥物篩選和藥物敏感性等體外藥物相關實驗。

1. 靶向藥物：傳統應用二維細胞培養體系是由于其相比于體內移植瘤模型具有易用性、重復性、低成本和高效益的優勢。而惡性細胞與周圍微環境的相互作用及其氧氣、營養梯度和pH值等的差異，使體外二維細胞培養體系與腫瘤宿主體內的“真實世界”存在著明顯的對藥物應答敏感性的差異，這些差異對有效性治療藥物的篩選產生了障礙。微器官培養技術的成功應用，構成了包含大量良、惡性前列腺組織微器官培養細胞信息的“百科全書”，可在體外應用于臨床疾病譜藥物的篩選。這本“百科全書”記錄了每一個微器官培養細胞詳細的臨床和分子生物學特征、疾病的特點、治療的反應、突變的位點和基因表達譜等豐富的基本信息，可建立大數據平臺，提供成本和時間最佳效益的治療方法并應用于新藥的研發，預測這項技術能夠提供個性化治療靶點和靶向藥物合成的新思路[5]。

此外，循環腫瘤細胞（CTC）的體外微器官培養技術開啟了一個非常令人興奮的新的腫瘤診治策略評估渠道，簡單的抽血取代了有技術性挑戰的轉移位置的活檢，避免了病人的痛苦。關于循環腫瘤細胞在轉移灶中和在原發性腫瘤組織中的生物學特性，仍有爭議，有待進一步的研究。最近有研究表明，可間接地培養循環腫瘤細胞來進行乳腺癌靶向治療的篩選，這預示著循環腫瘤細胞微器官技術也可用于研究相關晚期實體器官的惡性腫瘤[30]。前列腺癌循環腫瘤細胞的應用也指日可待。

2. 藥物療效：醫療衛生監管機構要求在人類臨床治療試驗之前必須進行動物實驗，各種各樣的腫瘤模型已經應用于評估腫瘤藥物和生物治療等的療效，其包括先天免疫缺陷小鼠腫瘤移植瘤模型和基因工程小鼠模型等，這些模型受費用、腫瘤生長時間以及有效藥物篩選方式等的明顯限制，并且小鼠的生理學特性和對治療的敏感性等也潛在地混淆了對藥物篩選、效果和毒性的判斷[5]。個體化腫瘤的基因改變均具備特異性，靶向藥物的目的就是基于個性化治療的基礎上確定治療目標的最大效應，而大部分抗腫瘤化學藥物僅選擇性地對一部分病人有益。如果體外試驗能有力地證明某種藥物對某一部分特異性人群有益，且能在全部人群中有明顯的統計學意義，該藥物就能夠被批準應用，對于個體病人來說，會避免無效藥物的過度性治療以及有效藥物的缺乏。隨著前列腺癌微器官培養技術的發展和優化，從活檢標本收集足夠的材料，到新一代測序技術的普及和提高以及高效的臨床和體外治療試驗的進行，這些新技術將是腫瘤診治的重大的科學進步。

然而，目前還不清楚體外微器官培養對治療的應答與其在體內應答的差異，正在進行新建立的癌細胞系對治療的應答情況的回顧性研究。在微器官培養應用于臨床藥物試驗之前，還需要大量仔細的前瞻性驗證研究。

四、研究前景及展望

與常規二維細胞培養相比，應用前列腺癌微器官培養技術培養的癌細胞，其形態、組織結構、基因DNA狀態、表達譜及基因信號傳導途徑特性等更符合人體腫瘤的實際生物學特性。很多腫瘤治療的藥物常常由于無法在動物模型或體外研究中獲得準確的藥物效應和毒性反應數據，而在臨床試驗階段即被終止，浪費了大量的人力和物力資源。利用先進的微器官培養體系進行臨床前期藥物的療效和安全性的評價和篩選，可大大降低藥物研發的風險。人前列腺癌微器官培養技術可應用于前列腺癌的發病機制、發生發展過程和分子機制以及癌細胞的生長、侵襲、轉移、與腫瘤微環境的相互作用等腫瘤生物學行為的研究；通過結合新一代基因分析等生物信息學技術，可篩選合適的靶向藥物或特異性藥物，結合其對化療和放療等綜合治療方式的敏感性，以達到實現腫瘤個體化精確治療的目的。

微器官培養是一種新近發展的應用型技術，其用于前列腺癌的臨床和基礎研究還存在不成熟之處。相對于體內包括免疫系統在內的實際繁雜多變的內環境，體外微器官培養還只能模擬靜態和短暫的體內微環境，尚不能完全取代二維細胞培養和動物模型。但微器官培養技術作為一種新的研究工具，具有二維細胞培養和動物模型的優點和自身的獨特優勢，有望成為腫瘤體外研究的新標準，在腫瘤臨床和基礎研究領域中有廣闊的應用前景，綜合應用可望最終達到改善前列腺癌患者預后、降低病死率和延長終末生存期的目的。

致謝：本研究課題受國家自然科學基金（NSFC #81372772）、江蘇特聘教授科研基金[蘇教師（2012）34 號]和江蘇高校優勢學科建設工程資助項目等資助

關鍵詞器官培養技術; 前列腺腫瘤

參 考 文 獻

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（2015-01-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.001

中圖分類號R 737.25