不良生活習慣對精子DNADNA碎片的影響

徐杰偉 黃永漢 劉雄春 陳美玲中山大學附屬佛山醫院, 佛山市第一人民醫院生殖醫學中心（廣東佛山 528000）

不良生活習慣對精子DNADNA碎片的影響

徐杰偉 黃永漢 劉雄春 陳美玲
中山大學附屬佛山醫院, 佛山市第一人民醫院生殖醫學中心（廣東佛山 528000）

摘要目的分析吸煙、喝酒、桑拿生活習慣對精子DNA碎片化的影響，尋找不育癥患者的不育影響因素。方法在113例門診患者中，77例男性不育癥患者分為3組：A組為有吸煙/喝酒習慣31人，B組為有桑拿習慣21人，C組為其他不育癥25人。另外D組為生育能力正常36人。應用精子染色質結構分析（SCSA）檢測以上各組的精子DNA碎片化指數（DFI），分別比較各組間的差異。結果精子DNA碎片化指數（DFI）：A組為（29.03±11.41）%、B組為（28.12±9.56）%、C組為（24.08±6.27）%、D組為（14.87±3.54）%。A、B組分別高于C組，A、B組間比較差異無統計意義（P＞0.05），A、B組分別與C組比較有差異（P＜0.05）；A、B、C組分別與D組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。結論男性不育癥患者精子DNA碎片化指數（DFI）與正常生育人群有顯著性差異，不良生活習慣會加重精子DNA碎片化指數（DFI），可能是引起男性不育的因素。

關鍵詞吸煙; 飲酒; 蒸氣浴; DNA碎片裂

近年來， 隨著我國男性不育患者人數的增多，有害環境對生育的不良影響越來越受到關注。吸煙、喝酒、桑拿等生活習慣對男性生育能力的影響也越來越受到關注，有研究證實，不良的生活習慣可能影響生殖細胞的成熟和增殖， 甚至直接損害精子，導致精子 DNA 損傷[1-3]，本文將有吸煙、喝酒、桑拿等生活習慣的男性不育患者與生育健康的男性進行比較，現將結果報告如下。

資料與方法

一、研究資料

男性不育診斷標準：夫妻雙方未采取避孕措施并且有規律性生活 1 年以上而未受孕， 排除女方因素即可診斷為男性不育。

（一）研究對象

研究對象為2012年8月至2013年6月在佛山市第一人民醫院生殖中心男科門診就診的男性不育患者77例，分為3組：A組31例，平時有吸煙喝酒的生活習慣（不喜歡桑拿），每天1包煙/每周至少喝酒3次，已有2年以上吸煙喝酒史的患者31例，年齡20～42歲，平均年齡31歲；B組21例，平時有桑拿的生活習慣（不喜歡吸煙喝酒），每周至少2次，并有1年以上桑拿史，年齡20～44歲，平均年齡32歲；C組25例，排除有吸煙、喝酒、桑拿生活習慣的其他不育癥患者，年齡22～42歲，平均年齡32歲。另外D組36例，有正常生育能力，且沒有不良生活習慣（女方有不孕原因）的患者，年齡20～40歲，平均年齡30歲。

（二）精液標本采集

排除近半年內有持續高熱者或精液白細胞 ＞.0×106/mL患者；禁欲2～7d，手淫法采集全部精液于干燥專用采集杯中，置37℃電熱恒溫水浴箱內液化。

二、儀器與試劑

（一）儀器

美國BD公司FACS Calibur流式細胞儀；美國

AMILTON THORNE BIO-SCIENCES 公司 Version 4 IVOS 精液分析儀。

（二）流式細胞儀試劑

按照孫靜波等[4]方法改進配置自配試劑：（1）0×TEN 緩沖液；（2）酸處理液；（3）1 g/L吖啶橙（AO）儲存液；（4）染色緩沖液；（5）AO染液；（6）AO平衡緩沖液。存放在4℃冰箱備用，使用時所有試劑和緩沖液保持在4℃冰水中進行。

三、方法

（一）精液分析

精液液化后以 WHO《人類精液檢查與處理實驗室檢驗手冊》（第5版）推薦的正常參考值為參照標準，用美國HAMILTON THORNE BIO-SCIENCES公司 Version 14 IVOS 精液分析儀對精液進行常規參數檢測，記錄精液體積、精子濃度、精子前向運動率（PR）、精子非前向運動率（NP）及精子不動率（IM）。

（二）精子染色質結構分析（sperm chromatin structure a ssay，SCSA）

1. 根據 CASA 結果中的精子濃度，用4℃TEN 緩沖液稀釋成5×106/mL的精子懸液于精子凍存管，放入4℃冰箱中，在6h內測定。

2. 按照 Evenson 等[5]方法稍加改進，調整流式細胞儀激發光波長488nm和二色濾光片，在峰頂或峰高收集紅色熒光（≥630 nm），用AO平衡緩沖液平衡流式細胞儀樣品通道。

3. 取50μL稀釋精子懸液于進樣管中，加入100μL酸處理液（pH1.2），旋渦輕輕混合30s，加300μL AO染液染色后低速流動樣品2 min，檢查精子流速，如果太快（＞300個/s）重新稀釋。每個樣品獲取和存儲1 000個精子的紅色熒光，用專門的軟件處理得出的精子DNA碎片化指數（DFI）。

四、統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件，統計數據結果用x±s表示，用t檢驗進行兩組間比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、4組精子DFIDFI的比較

A 組DFI為（29.03±11.41）%，高于B組[（28.12±9.56）%]和C組[（24.08±6.27）%]，D組為（14.87±3.54）%。A、B組分別與C組比較差異有統計學意義（P＜0.05）， A組與B組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A、B、C組分別與D組比較有顯著性差異（P＜0.01），見表1，圖1。

二、精液分析常規參數

精液體積、精子濃度及精子非前向運動率（NP%）的結果，A、B、C、D組間比較沒有差別（P＞0.05）；精子的前向運動率（PR%）及不動率（IM%）結果，A、B、C組間比較沒有差異（P＞0.05），A、B、C組分別與D組比較有顯著性差異（P＜0.05），見表2。

表1 4組精子DFIDFI比較

圖1 4組DFIDFI的散點圖

表2 4組精液常規參數比較

討 論

隨著醫學發展，臨床和實驗室的相關診斷或檢測也不斷進步，能夠對男性不育患者病因進行確診，但仍有30%左右的男性不育患者并不能找到不育原因。在男性不育患者中精子DNA損傷是很重要的臨床研究領域，精子DNA受損可能是精子發生過程中DNA轉化出現異常，也可能與精子自身的凋亡有關。Larson等[6]研究認為，精子DNA受損在不明原因不育男性患者中的比率較高，可能為男性不明原因不育的一種解釋。精子DNA 的完整性是遺傳物質正確傳遞給子代的前提，在受精和胚胎發育中發揮重要作用[7]。許多研究[8-10]表明精子DNA 損傷會造成男性不育。

從本研究精子DNA碎片化指數（DFI）實驗數據可知，有不良生活習慣不育癥組（A、B組）比沒有不良生活習慣不育癥組（C組）的DFI均值高，不育癥組（A、B、C組）比有正常生育能力組（D組）的DFI均值高，本實驗在研究對象選擇時就排除了發燒、感染的影響因素，但實際生活中還存在很多不為人知的不育影響因素有待不斷探索，因此在C組的實驗數據中去除了偏差特別大的DFI數據。從本實驗DFI統計數據結果可知，A、B組分別與C組比較有顯著性差異（P＜0.05），說明不良生活習慣會加重精子DNA損傷，產生更多的碎片，人們生活中的不良生活習慣的確對正常生育造成一定的影響。從精液常規分析常規參數結果可知，在不育癥組（A、B、C組）中精子前向運動率（PR）及精子不動率（IM）組間比較沒有顯著性差異（P＞0.05），而DFI指標在A、B組分別與C組比較有顯著性差異（P＜0.05），說明精液常規參數與DFI不一致，精液常規結果正常的精液標本也有部分存在精子DNA損傷嚴重，出現較高的DFI值，這與相關文獻報道一致[11]，精子DNA碎片化檢測有更進一步的意義。在不育癥組（A、B、C組）分別與有正常生育能力組（D組）比較中，統計數據結果顯示DFI組間比較有顯著性差異（P＜0.01），說明不育組精子DFI顯著高于有正常生育能力組，這與國內外相關文獻報道一致[12-14]。在不育癥組與有正常生育能力組比較中精液體積、精子濃度及精子非前向運動率（NP）組間比較沒有顯著性差異（P＞0.05）、精子前向運動率（PR）及精子不動率（IM）組間比較有顯著性差異（P＜0.05）。從上面結果可知，精子DFI指標與PR及IM常規參數有相關，存在數據統計結果一致性，說明精液常規結果異常的精液標本通常情況下，其精子DNA損傷程度比較重，產生精子DNA碎片較多[11]。

在男性不育患者中，精子DNA損傷可能是獨立的精子質量評價指標[15]，對男性不育患者行精子DNA損傷檢測并尋求改善精子DNA損傷的方法具有重要的臨床意義。吸煙作為一項不健康的生活習慣，是影響男性生育能力的一個重要危險因素。香煙中含有尼古丁、一氧化碳、 鎘等有害物質，這些有害物質可影響男性睪丸生殖細胞， 具有抑制性激素分泌和殺傷精子的作用[16]。有人研究[17]， 煙草濃聚物及其代謝產物中富含誘基因突變和誘癌物質，造成精子DNA合成受阻，產生突變，導致精子DNA損傷。這與本文研究結果一致。酒的主要成分是水和乙醇，乙醇可通過對人體生殖功能造成不同程度的破壞導致不育[18]，其發生機制可能與下列原因有關：酒精可破壞睪丸間質細胞，抑制了睪丸內維生素A的活性， 導致生精功能降低，出現少精子癥或無精子癥；酒精使精子 DNA 的高甲基化印跡區域去甲基化,從而使精子DNA合成障礙[19-21]。精子最適宜的溫度是20～40℃，過高過低都會影響精子的活動力，造成精子死亡，而導致精子DNA的損傷[22]。

綜上所述，吸煙、喝酒或桑拿等不良生活習慣的確損傷精子DNA的完整性。精子DNA碎片化檢測作為精液常規檢查的補充，在評價男性不育中有重要臨床意義，是較好的評估精液質量和男性生育能力的參考指標。

參 考 文 獻

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（2014-11-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.009

中圖分類號R 698.2

The effects of unhealthy lifestyle on DNA fragmentation index

Xu Jiewei, Huang Yonghan, Liu Xiongchun, Chen Meiling
Department of the Reproductive Center, Foshan Hospital Affi liated to Sun Yat-san University/the First People's Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong, China

AbstractObjective To investigate the effects of cigarette, alcohol and taking sauna on DNA fragmentation index (DFI) in infertile males, and fi nd out impact factors related to infertility. Methodsthods Total of 113 male patients including 77 infertile males and 36 with normal reproductive ability were recruited in the study. All patients were classifi ed into Group A(31 infertile males with a habit of smoking/taking alcohol), Group B( 21 infertile males with a habit of taking sauna), Group C(25 infertile males with other relative pathogenesis) and Group D(36 males with normal reproductive ability as control). Semen samples were collected from each patients and their DFI were detected by a sperm chromatin structure assay (SCSA). Resultssults DNA fragmentation index in Group A, Group B, Group C and GroupD was 29.03±11.41%, 28.12±9.56%, 24.08±6.27%, and 14.87±3.54%, respectively. No signifi cant difference in DFI was found between Group A and B(P>0.05). DFI in Group A and Group B were significantly higher than that in Group C (P<0.05). DFI in Group A、B and C was signifi cantly different from that in Group D, respectively (P<0.01). Conclusionusion DFI is higher in infertile males than that in males with normal reproductive ability. And unhealthy lifestyle may affect DFI of their sperm, and further result in infertility.

Key wordsords smoking; Alcohol Drinking; Sauna; DNA fragmentation