基因芯片技術在臨床微生物檢驗中的應用和優勢

湯桂麗

（中國人民解放軍廣州軍區武漢總醫院，湖北 武漢 430010）

基因芯片技術在臨床微生物檢驗中的應用和優勢

湯桂麗

（中國人民解放軍廣州軍區武漢總醫院，湖北 武漢 430010）

基因芯片技術作為一種前沿生物技術，具有靈敏、快速、高通量的優點，在醫學的各個領域和臨床微生物檢驗中都有廣泛的應用。該文就基因芯片技術在臨床微生物檢驗中的應用和優勢進行了簡要綜述。

基因芯片技術；臨床微生物；應用；優勢

基因芯片技術(gene chip technology，GCT)可以準確、快速、及時地診斷感染性疾病的病原體[1-2]，對患者感染性疾病的臨床治療、預后具有重要價值[3-5]。傳統的抗體檢測法(antibody detection method)、病原體培養法(pathogen culture method)等，操作煩瑣且所需周期較長[6-7]，GCT的出現和成熟為臨床微生物的檢驗提供了有力的技術條件。現就GCT在臨床微生物檢驗中的應用和優勢進行了簡要的綜述。

1 應用背景及現狀

GCT是在20世紀80年代隨著“人類基因組計劃”的發展，90年代中期興起的一種新技術，可超高通量檢測基因表達[8]。其主要原理是將寡核苷酸探針或DNA以一定的順序和密度固定在載體(如硅片、玻片、NC膜、塑料片等)上，與核酸分子(用熒光染料或放射性核素標記)進行雜交，通過對雜交信號檢測、分析，獲得樣品中大量的基因表達信息。GCT具有信息量大、快速、可進行高通量篩選以及數據一致性好等優勢[9]。目前，GCT已在生命科學的多個領域中顯示其發展潛力，并為臨床微生物檢驗提供了良好的發展前景，已廣泛應用于臨床微生物的基因組、基因變異性、基因多態性分析以及致病機制、感染后宿主機體基因表達的變化等方面的研究[10]。GCT的日趨完善，使臨床微生物檢驗和抗生素敏感性測試可同步進行，將使臨床微生物檢驗更上一個臺階。

2 細菌檢測

2．1 分析臨床微生物基因組、基因變異性及多態性

基因芯片檢驗病原菌的原理基于細菌的16S rRNA基因的高度保守性[11]。rRNA被稱為細菌的“活化石”，原因是該基因高度保守且進化速度緩慢，可作為細菌生命的標志[12]。rRNA基因包括23S(長3．3kb)、16S(長1．6kb)和5S(僅長0．12kb)3個基因。目前，最常選用16S rRNA作細菌的分類和鑒定的基因，主要原因是16S rRNA基因長度適中[13]，可作為細菌分類“金指標”。16S rRNA基因與真核生物明顯不同的高度保守序列不少于9個[14]，為細菌所共有，目前基因庫幾乎包含所有已知細菌的16S rRNA基因的堿基序列。根據RNA易降解的特點，多采用檢測16S rRNA對應染色體上的16S rDNA堿基序列序列，16S rDNA內部結構分為可變區與保守區(為細菌所共有，存在9～10個變異區(V1～V10)兩部分，兩部分交錯排列，不同種屬間會有一定差異。對同一種細菌其基因組的同源性應不小于70%，而對于16S rDNA，不同種屬的判定標準為差異在3個堿基以上，可用于細菌的分類和鑒別[15]。Han Bingbing等[16]采用GCT對4種細菌(大腸桿菌、傷寒桿菌、空腸彎曲菌、痢疾桿菌)進行鑒別診斷，在設計這種鑒別診斷芯片時，以兩種靶基因(一是各菌種間的差異序列，二是同種細菌不同血清型所特有的標志基因)固著于芯片表面，同時還含有細菌所共有的16S rDNA保守序列以確定為細菌感染的標志。與傳統方法相比，該方法敏感度高、操作簡單、診斷效率高、重復性好且節省時間[16]。

2．2 檢測細菌耐藥基因

為了避免臨床無指征濫用抗菌藥物，需準確及時地檢測病原菌的耐藥性，這樣可有效預防耐藥菌(drug-resistant bacteria，DRB)以及多重耐藥菌的產生[17-18]。傳統主要依靠培養法對細菌耐藥性進行檢測，普通細菌約需2 d可出結果，而對于生長速度極慢的結核桿菌(N／med tuberculosis bacilli，NTB)則需3～4周時間。國外研究人員采用GCT檢測耐藥基因[19]，如Michael Wilson就曾使用此方法檢測到NTB中脂肪酸合成酶Ⅱ(Fatty acid synthaseⅡ，FACⅡ)，efpA，fbpC，fadE23，fadE24及ahpC基因的改變與細菌耐藥性有關。美國（NARC）利用研制出的基因芯片來檢測NTB對利福平(rifampicin)、乙胺丁醇(ethambutol)及異煙肼(isoniazid)的耐藥性，檢出率分別為75%，70%及50%。采用GCT可同時檢測耐藥菌的多個耐藥基因，也可同時檢測多個耐藥菌的多個耐藥基因[20]。找到耐藥菌的耐藥基因，不僅可將耐藥菌分成不同的亞型以便在臨床使用相應的抗菌藥物，還可通過研究與藥物相對應的特殊靶向基因，尋找能夠預測個體對藥物敏感性的基因，對新型抗菌藥物的設計也有幫助，可以制訂出個人藥物敏感譜，對臨床用藥以及新藥的合成均起指導作用，進而改善治療效果。

3 病毒檢測

3．1 快速診斷流感病毒

對流感病毒(flu virus，FV)基因組的研究發現，其病毒膜蛋白M1由其RNA第7節段編碼，甲型FV M基因編碼252個氨基酸的M1蛋白，乙型FV M基因編碼248個氨基酸的M1蛋白，均非常保守，且兩型病毒M1蛋白間只有63個氨基酸相同，型特異性明顯，故M基因即可以診斷FV并對其分型，又不受抗原變異以及漂移的影響，可長期使用，是流感病毒分子診斷的基礎[21]。

3．2 檢測肝炎病毒及其致病性相關研究

基因芯片可對肝炎病毒(hepatitis virus，HV)的分型、變異、突變及病毒核酸含量進行高通量、平行檢測。臨床對獻血員的丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)篩查主要是通過檢測血中的HCV抗體、HBV抗原和抗體，而利用基因芯片將HCV及HBV的特異性基因片斷固著于芯片上，可直接對血液中兩種Virus的病原體同時進行檢測，為了提高檢測效率也可將多種熒光標記樣本同時雜交于1張芯片上[22]。目前，在肝炎的抗病毒治療中產生的病毒耐藥突變，最典型者為拉米夫定(3TC)抗HBV治療中出現的YMDD變異。

3．3 檢測人類免疫缺陷病毒及感染后宿主機體基因的表達

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的檢測方法目前最常用的是血清學 HIV抗體檢測，以 gpl60／gpl20，gp41，p31和p24這4種抗體均為陽性作為確診HIV感染的診斷標準[1]。基因芯片將鏈擴增技術(PCR)與核酸分子雜交完美結合，通過對HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標，可以直接對病毒病原體進行檢測，在抗體產生之前即可作出早期診斷。

4 性傳播疾病檢測

基因芯片利用核酸分子堿基互補配對原理，將多種病原體特異基因序列(探針)提取后以微陣列方式固定于芯片上[23]，使其與標記的樣品核酸分子雜交，通過檢測雜交信號強度，獲取樣品核酸分子的數量和序列信息，從而針對一份生物樣品，可同時檢測多種性傳播疾病的病原微生物。利用GCT檢測性傳播疾病的病原體相對目前被廣泛應用的ELSA及PCR檢測技術，具有特異性、靈敏度高，假陽性率和假陰性率低，操作快速、簡便，自動化程度高、結果客觀性強等優點，彌補了傳統技術的不足，如ELSA可能出現交叉免疫現象，PCR技術時常發生假陽性或假陰性，從而避免了誤診現象的發生。診斷的病原體主要有梅毒、生殖器皰疹、淋病、巨細胞病毒感染癥、尖銳濕疣、非淋菌性陰道炎、外陰陰道白色念珠菌病等多種性傳播疾病[24]。

5 前景

近年來，GCT的應用前景非常廣闊，但在技術和應用上仍存在很多需要解決的問題。首先，由于探針的雜交有一定的錯配率，從而產生一定的背景。如何區分這種背景所造成的假陽性和由于標本中病原體拷貝數太低所造成的弱陽性，是臨床微生物芯片面臨的主要挑戰。對臨床微生物來說，多數都是原核生物，其共同特點是沒有polyA尾，因此無法像真核生物那樣通過polyA尾純化mRNA，并用反轉錄方法建立cDNA文庫。因此，如何方便、快捷地建立病原微生物的檢測探針是基因芯片亟待解決的瓶頸。其次，樣品的處理和應用也面臨著很多干擾因素，對于常規病原微生物檢測芯片的應用，需要提高芯片診斷的靈敏度和特異性。如何正確地對樣品進行簡單的處理，使混雜因素降到最低，是日常工作者面臨的問題。特別是蛋白質芯片技術發展緩慢，如何使各種蛋白質穩定地固定于芯片載體上，如何保持點樣蛋白的天然構象和生物學活性等問題，尚有待進一步解決。盡管存在一定的不足和缺憾，GCT與傳統微生物的檢測方法相比，仍具有檢測系統微型化、對樣品的需要量非常少、檢測效率高、能同時分析多種基因組或診斷用DNA序列的優勢，同時還能檢測宿主細胞基因組的轉錄情況，有助于揭示發病機制及感染性疾病的診斷和治療，因此具有廣闊的應用前景。

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Application and Advantage of Gene Chip Technology in Clinical Microbiological Detection

Tang Guili
(Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Region,Wuhan,Hubei,China 430010)

The gene chip technology as a kind of frontier biotechnology has the advantages of sensitivity,rapidness and high throughput, and has a wide range of applications in various fields of medicine and clinical microbiological detections．The application and superiority of the gene chip technology in the clinical microbiological detection are briefly reviewed．

gene chip technology;clinical microbiology;application;advantage

R446.61

A

1006-4931(2015)05-0092-03

2014-09-11)