三叉苦葉中三個黃酮類化合物的體外抗炎活性研究

□ 魏荷琳 曾邦國 肖隆祥 宋成英 伍朝君

炎癥是具有血管系統的活體組織對各種損傷因子的刺激所發生的防御反應，典型的反應是出現紅、腫、熱、痛和功能障礙等臨床癥狀，是機體對內外環境中有害刺激所產生的一種復雜的生理和病理反應［1］。近代藥理學研究表明炎癥與人體感染、心腦血管病、腫瘤、神經退行性疾病、變態反應等許多重大疾病的發生和發展過程相關。

三叉苦為蕓香科吳茱萸屬植物三椏苦(Euodia lepta(Spreng.)Merr.)的莖及帶葉嫩枝，又名三叉虎、三丫苦等。三叉苦性寒，味苦，有清熱解毒、祛風除濕的功效，主治咽喉腫痛、黃疸型肝炎、濕疹、皮炎等［2］。《南寧市藥物志》記載其有清熱解毒、舒筋活絡、祛風濕、止癢的功效;《嶺南采藥錄》記載其可清熱毒，治跌打損傷、瘡瘍、瘧疾;《廣州部隊常用中草藥手冊》記載其有清熱解毒、燥濕止癢的功效，可防治流感、流腦、乙型腦炎，治療扁桃體炎、咽喉炎、濕疹、皮炎、痔瘡等。三叉苦作為嶺南地區傳統應用的一種地方中草藥，是目前市售很多成方制劑中的主要藥味，如999感冒靈顆粒、三九胃泰、三金感冒片等。但關于三叉苦的現代藥理研究十分薄弱，對于其發揮藥效的活性成分尚未闡明。因文獻所記載的三叉苦藥用功效大多和炎癥有關，所以為了尋找三叉苦中的抗炎活性成分，本文在研究三叉苦葉的化學成分基礎上，將分離得到的三個黃酮類化合物 pteleifolosin C、3，5，3＇-trihydroxy-8，4-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enyloxy)flavone和 3，5，4＇-trihydroxy-8，3＇-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enoxy)flavone，以LPS誘導的 BV-2細胞對三個化合物進行了抗炎活性體外篩選，結果表明三個化合物均有較好的抗炎活性。

一、實驗部分

(一)細胞及試劑。BV-2細胞(由北京協和醫科大學提供)，實驗用細胞處于對數生長期;DMEM培養基(Hyclone，美國);胎牛血清(FBS，Hyclone，美國);NO化學法試劑盒(南京建成生物公司);陽性對照用槲皮素(Sigma，美國);細菌脂多糖(LPS，Sigma，美國)。

Griess試劑A:0.1%N-萘乙二胺鹽酸鹽;Griess試劑B:5%H3PO4含1%對氨基苯磺酸酰胺。

(二)實驗樣品及配制方法。實驗用三個黃酮類化合物為本實驗室自制。化合物信息如表1。

表1 化合物信息表

化合物結構鑒定過程如下。

化合物1:黃色固體;HCl-Mg粉反應陽性;香草醛-硫酸噴霧顯黃色斑點;EI-MS:m/z 384［M］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.43(1H，s，5-OH)，7.71(1H，d，J=2.0 Hz，H-2＇)，7.68(1H，dd，J=2.0，9.0 Hz，H-6＇)，7.01(1H，d，J=9.0 Hz，H-5＇)，6.72(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.34(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.46(1H，t，J=6.5 Hz，H-2＇＇)，4.65(2H，d，J=6.5 Hz，H-1＇＇)，3.85(3H，s，4＇-OCH3)，1.76(3H，s，H-4＇＇)，1.73(3H，s，H-5＇＇);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:175.7(C-4)，163.8(C-7)，159.9(C-5)，155.7(C-9)，149.1(C-4＇)，146.4(C-3＇)，145.8(C-5)，137.8(C-3＇＇)，136.0(C-3)，123.0(C-1＇)，119.4(C-6＇)，118.7(C-2＇＇)，114.4(C-2＇)，111.4(C-5＇)，103.6(C-10)，97.6(C-6)，92.2(C-8)，64.9(C-1＇＇)，55.3(4＇-OCH3)，25.0(C-4＇＇)，17.7(C-5＇＇)。

以上數據與文獻［3］對照一致，確定該化合物為pteleifolosin C。

化合物2:黃色固體;HCl-Mg粉反應陽性;香草醛-硫酸噴霧顯黃色斑點;ESI-MS:m/z 413［M-H］-;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.23(1H，s，5-OH)，9.55(1H，s，3-OH)，9.41(1H，s，3＇-OH)，7.72(1H，d，J=1.5 Hz，H-2＇)，7.70(1H，dd，J=1.5，8.0 Hz，H-6＇)，7.12(1H，d，J=8.0 Hz，H-5＇)，6.58(1H，S，H-6)，5.48(1H，t，J=6.5 Hz，H-2＇＇)，4.69(2H，d，J=6.5 Hz，H-1＇＇)，3.85(3H，s，4＇-OCH3)，3.82(3H，s，8-OCH3)，1.77(3H，s，H-4＇＇)，1.74(3H，s，H-5＇＇);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:176.3(C-4)，157.0(C-7)，155.6(C-5)，149.5(C-3＇)，147.7(C-9)，146.7(C-3＇)，146.3(C-2)，138.3(C-3＇＇)，136.1(C-3)，128.5(C-8)，123.5(C-1＇)，119.8(C-6＇)，119.1(C-2＇＇)，114.5(C-5＇)，111.9(C-2＇)，103.4(C-10)，96.2(C-6)，65.7(C-1＇＇)，60.9(8-OCH3)，55.6(4＇-OCH3)，25.4(C-4＇＇)，18.1(C-5＇＇)。以上數據與文獻［4］對照一致，確定該化合物為3，5，3＇-trihydroxy-8，4＇-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enyloxy)flavone。

化合物3:黃色粉末;EI-MS:m/z 414［M］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.23(1H，s，5-OH)，9.79(1H，s，4＇-OH)，9.54(1H，s，3-OH)，7.78(1H，d，J=2.0 Hz，H-2＇)，7.73(1H，dd，J=2.0，8.5 Hz，H-6＇)，6.98(1H，d，J=8.5 Hz，H-5＇)，6.58(1H，S，H-6)，5.47(1H，t，J=6.5 Hz，H-2＇＇)，4.69(2H，d，J=6.5 Hz，H-1＇＇)，3.85(3H，s，3＇-OCH3)，3.83(3H，s，8-OCH3)，1.77(3H，s，H-4＇＇)，1.74(3H，s，H-5＇＇);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:176.2(C-4)，157.0(C-7)，155.6(C-5)，149.0(C-4＇)，147.7(C-9)，147.4(C-3＇)，146.9(C-2)，138.3(C-3＇＇)，135.9(C-3)，128.5(C-8)，122.1(C-1＇)，121.8(C-6＇)，119.2(C-2＇＇)，115.7(C-5＇)，111.3(C-2＇)，103.4(C-10)，96.2(C-6)，65.8(C-1＇＇)，60.9(8-OCH3)，55.6(3＇-OCH3)，25.4(C-4＇＇)，18.1(C-5＇＇)。以上數據與文獻［5］對照一致，確定該化合物為 3，5，4＇-trihydroxy-8，3＇-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enoxy)flavone。

所有待測樣品均配制成濃度為10 mM的DMSO溶液，臨用時根據需要稀釋。

(三)實驗方法。BV-2小膠質細胞用DMEM培養基(加 10%FBS、100 μg·L-1青霉素和 100 μg·L-1鏈霉素)培養于5%CO2，37℃的培養箱中，傳代接種24 h后用于實驗。實驗時，將LPS(1 mg·L-1)作用于BV-2細胞到指定時間，建立神經炎癥模型，使用Gress法［6］測定NO的含量，計算IC50值。

將實驗分為對照組、槲皮素陽性組、LPS誘導組、給藥組。對照組采用以上DMEM培養液補充體積，其他組用LPS(1 mg·L-1)誘導炎癥。陽性組采用槲皮素處理細胞，給藥組采用上述化合物協同LPS(1 mg·L-1)處理細胞，以5×104cells·mL-1密度接種于96孔板，每個樣品重復測試4次，于37℃、5%CO2條件下培養24小時后，取100μL細胞上清液至酶標板中，加入等體積的Griess試劑，室溫反應10min后測定570nm處的吸收值(OD值)。使用亞硝酸鈉標準液繪制標準曲線，根據標準曲線計算細胞培養上清液中NO2-的濃度以及對NO釋放的抑制率。

二、實驗結果

以槲皮素為陽性對照，按照上述實驗方法進行實驗，初篩結果如表2。

表2 抗炎活性結果

從上述實驗結果，可以得出3個化合物均表現出較好的體外抗炎活性，即對LPS誘導BV-2細胞產生NO的抑制率較高。

三、結語

三叉苦作為嶺南地區已經習用的一種地方中藥，隨著目前很多成方制劑的熱銷，臨床應用越來越廣泛。但關于三叉苦的藥理作用的現代研究少有報道，對于其發揮臨床藥效的活性成分尚未闡明。

本文在查閱三叉苦臨床應用文獻的基礎上，對從三叉苦葉中分離得到的三個黃酮類化合物進行體外活性篩選，結果顯示三個化合物均有較好的體外抗炎活性，該研究結論與文獻記載的按傳統中醫理論總結的藥物功效相一致。本文研究了三叉苦中部分化合物的體外抗炎活性，要充分闡明三叉苦的藥效物質，亟待從整體上多種主要成分進行相應的體內外藥效學評價。

［1］侯曉麗，孫銘學，高煥煥等.抗炎天然產物活性成分研究進展［J］.藥學實踐雜志，2015，33(1):20 ～26

［2］江蘇新醫院.中藥大辭典［M］.上海:上海科學技術出版社，1992:68

［3］Zhu S H，Gao Y H，Wei Z X，et al.A new phenylated flavone from Melicope pteleifolia［J］.Chin Herb Med，2011，3(2):81～83

［4］謝郁峰，梁粵，杜清濤等.三椏苦化學成分研究［J］.中藥材，2011，34(3):386 ～388

［5］Nasim S，Thomas G H，Peter G W，et al.Two novel prenylated flavones from the aerial parts of Melicope micrococca［J］.Phytochemistry，1999，50:1249 ～1253

［6］Green L C，Wagner D A，Glogowski J，et al.Analysis of nitrate，nitrite，and［15N］nitrate in biological fluids［J］.Analytical Biochemistry，1982，126(1):131 ～138