家蠅新型抗菌肽A3基因的克隆與分析

□ 耿文一 楊 雪 唐 婷 柳峰松

一、引言

隨著抗生素的濫用和超級耐藥細菌的產生，昆蟲抗菌肽已成為新型抗菌藥物設計和開發的重要資源。家蠅中已經報道的抗菌肽有攻擊素(attacin)，天蠶素(cecropin)，防御素(defensin)和溶菌酶(lysozyme)［1］。抗菌肽的獲得可以通過許多方法，例如采用提取純化的方式獲得，但是提取工藝繁瑣;有研究是通過真/原核表達來表達純化抗菌肽［2］，由于抗菌肽的抑菌能力較強，該方法的成功率較低;也有研究運用抑制性消減雜交方法成功獲得免疫相關基因［3］。本文通過分析家蠅基因數字表達譜和轉錄組數據，發現細菌刺激后多條未知基因表達量顯著升高。分析其中1條基因編碼的多肽發現具有抗菌肽的典型特征，同時實驗證實根據其成熟肽合成的多肽具有廣譜抑菌活性。此基因是在家蠅中首次被發現的，并且在GenBank中找不到同源基因，將其命名為A3。

二、材料與試劑

(一)實驗材料。家蠅Musca domestica(Linnaeus)種蠅由中國科學院動物研究所何鳳琴老師惠贈，幼蟲由本實驗室飼養，飼養溫度為25℃，相對濕度為50% ～70%。

(二)主要試劑。實驗室所用試劑是TaKaRa公司產品，有RNAiso Plus、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pMD19-T載體、SYBR Green;南京金斯瑞科技有限公司產品有M-MLV反轉錄酶、Taq DNA聚合酶;蘇州金唯智生物有限公司合成引物。由上海默悉生物科技有限公司合成A3合成肽(純度大于95%)。

(三)主要菌種。攻毒實驗所用大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為本實驗室所保存。抑菌實驗所用菌種由中科院動物研究所朱順義研究員饋贈。革蘭氏陽性菌:巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，脲芽孢八疊菌(Sporosarcina ureae);革蘭氏陰性菌:嗜水汽單胞菌(Aeromonas hydrophila)，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，大腸桿菌(Escherichia coli)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

三、實驗方法

(一)總RNA的提取和反轉錄。按照使用說明書，用RNAiso Plus試劑提取家蠅幼蟲的總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用核酸定量儀測定其濃度和純度，各取1μg 總 RNA，以 AOLP(5＇-GGCCACGCGTCGACTAGTACT16(G/A/C)-3＇)為引物反轉錄合成cDNA。

(二)A3基因cDNA序列的克隆。參照家蠅轉錄組序列信息，設計A3基因特異正向引物A3-F1(5＇-AACCACATTACGCTAACACG-3＇)和特異反向引物 A3-R1(5＇-CATTAAATCGCGAGCCCTTTTTGA-3＇)，以家蠅幼蟲 cDNA為模板，進行 PCR 擴增，PCR 反應條件為:94℃、4min;94℃、30s，55℃、40s，72℃、1min，35 個循環;72℃延伸，10min。PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收后，連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α化學感受態細胞，PCR篩選陽性克隆后測序。

(三)A3抗菌肽的生物信息學分析。將上述測序結果進行生物信息學分析，利用Bioedit軟件搜索開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，翻譯成氨基酸序列。利用Signal 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找信號肽。成熟肽分子量、等電點及氨基酸組成在Antimicrobial Peptide Database(http://aps.unmc.edu/AP/)中預測。在NCBI網站上利用 Blastp程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行相似性比對。

(四)A3成熟肽合成。將A3成熟肽氨基酸序列VQRVLFPICTKGPFLHSLRDTDSLGRQLDPYVIR YQKKFGST發送到上海默悉生物科技有限公司進行合成。

(五)A3合成肽的抑菌活性實驗。將實驗菌株在37℃，220 rpm條件下震蕩過夜。將活化后的菌種以1%接種量接種到新鮮的液體培養基中，當OD600=0.2左右時，停止搖菌。將各菌株菌液用新鮮培養基稀釋100倍，備用。將A3合成肽用無菌水進行梯度稀釋，濃度分別是1 mM、200 μM、100 μM、20 μM、2 μM、0.2 μM、20 nM 和 2 nM。

我們對本實驗室的細菌菌譜進行大范圍的檢測。取其中一株細菌的稀釋菌液加入96孔板中，每孔加入菌液90 μl;多肽稀釋液以不同的濃度分別加入細菌稀釋液中，加入量為10 μl，23℃，100 rmp 震蕩培養 12 h。同時以分別加入 10 μl無菌水和10 μl氨芐青霉素(0.1 g/ml)作為陰性和陽性對照組。在OD600下檢測實驗組和對照組菌液的濁度，來判斷其是否具有抑菌活性，并測定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，MIC定義為與陰性對照組相比實驗組達到85%以上細菌死亡的多肽濃度。所有不同濃度的樣品要進行3次平行實驗。

(六)A3合成肽的溶血活性測定。抽取1 ml的兔靜脈血，立即與阿氏液(Alsever＇s Solution)混勻。用生理鹽水洗滌血細胞，2000 rmp，離心5 min，棄上清。用50倍體積生理鹽水重懸血細胞，并以200 μl每支分裝到1.5 ml離心管中。將多肽A3用生理鹽水稀釋成濃度梯度，分別為1 mM、204 μM、102 μM、20.4 μM、2.04 μM、0.204 μM、20.4 nM 和 2.04 nM。200 μl血細胞加入 4 μl肽液，37℃孵育30 min。3000 rmp，離心5 min，收集上清，在分光光度計上測定416 nm處吸光度值。陽性對照為用生理鹽水稀釋的10%Triton-X-100;陰性對照為生理鹽水。溶血率計算方法:溶血率(%)=［(AB)/(C-B)］×100%(A:實驗組吸光度值;B:陰性對照組吸光度值;C:陽性對照組吸光度值)。

四、結果

(一)家蠅A3基因cDNA序列及分析。經PCR克隆，獲得家蠅A3基因cDNA序列254 bp，包含198 bp完整的開放閱讀框，5＇末端非翻譯區12 bp，3＇末端非翻譯區44 bp。推導的A3多肽序列由65個氨基酸殘基組成(圖1)，圖中劃線部分為信號肽。成熟肽富含Leu(11.90%)和Arg(9.52%)(圖2)，疏水性氨基酸為14個，帶正電荷的氨基酸為8個，理論分子量為4881.4 D，等電點為9.86。Blastp分析后未發現A3基因的同源性序列。

通過對抗菌肽二級結構分析，A3成熟肽是由β-折疊和α-螺旋構成(見圖3)。從三級結構預測圖中可以看出，在C端有1個α螺旋，N端有2個反向平行的β片層(見圖4)。

圖1 家蠅抗菌肽A3基因cDNA序列及其推導的氨基酸序列

圖2 A3成熟肽的氨基酸組成

(二)A3合成肽的抑菌實驗結果。我們用實驗室已有的菌株來進行抑菌實驗。A3合成肽對多種細菌都有抑制作用，其中抑制作用最高的為革蘭氏陰性菌Serratia marcescens，其MIC 為30.73 μM。

(三)A3合成肽溶血實驗結果。從溶血實驗結果可以看出，合成肽的終濃度為1 mM時，其溶血效率為19.1%，說明A3對哺乳動物血細胞具有較低的溶血活性。

圖3 A3成熟肽的二級結構

圖4 A3成熟肽的三級結構

五、結語

本文根據家蠅EST序列篩選到一種新型的家蠅抗菌肽A3基因，合成A3成熟肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有抑制作用，且幾乎沒有溶血活性，因此A3在醫藥領域具有一定應用潛力。本研究不但從家蠅體內發現了一種新型抗菌肽，在新抗菌肽的發現方法方面也有獨到之處，在基因組學和轉錄組學迅速發展的今天，利用生物信息學作為指導，結合分子生物學實驗驗證，獲得新基因是一種方便可行的方法，可突破生物化學方法分離蛋白的難關，會加快新型抗菌肽的研發進程。

［1］Boman HG，Faye I，Gudmundsson GH，Lee JY，Lidholm DA.Cell-free immunity in Cecropia.A model system for antibacterial proteins［J］.Eur J Biochem，1991，201(1):23 ～ 31

［2］耿華，安春菊，郝友進，李德森，杜榮騫.家蠅攻擊素(Attacin)基因的克隆與表達［J］. 遺傳學報，2004，12:1344～1350

［3］Ito Y，Nakamura M，Hotani T，Imoto T.Insect lysozyme from house fly(Musca domestica)larvae:possible digestive function based on sequence and enzymatic properties［J］.J Biochem，1995，118(3):546～551