慢性腦缺血小鼠腦血管形態學變化的活體動態觀察

楠迪，郭淮蓮，何其華，宋江曼

慢性腦缺血可導致腦白質疏松、膠質細胞增生等病理改變，與血管性癡呆、阿爾茨海默病、Bingswanger病等緊密相關[1-2]。慢性腦缺血后腦血管形態學改變已引起廣泛關注[3]。以往對腦缺血后血管形態學改變的研究多采用免疫組化染色等方法觀察血管[3]，但該方法不能反映活體血管情況。近年來，有學者通過顱窗觀察腦缺血后腦血管的改變[4]，該方法可以活體動態觀察腦血管變化。利用封閉式顱窗活體動態觀察腦缺血后血管變化的研究國內尚未見報道。本研究旨在利用封閉式顱窗對小鼠慢性腦缺血后皮層血管變化進行活體動態觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性STOCK Tg（Tie2-GFP）287Sato/J小鼠，購自美國Jackson實驗室。共7只，8～12周齡，體重（25±5）g。本研究獲得北京大學人民醫院實驗動物倫理審查委員會的批準。

1.2 試劑與儀器 自酸蝕粘結劑（Heraeus Kulzer，德國）；Luxaflow流動樹脂（DMG，德國）；2.5%水合氯醛。牙科鉆（STRONG 207A，Seashin，韓國）；體視顯微鏡（SZXXTWZI，北京泰克匯光）；激光共聚焦顯微鏡（TCS SP5 Confocol，Leica，德國）；體溫保持裝置（BWT-100A，BRC，日本）。

1.3 顱窗制備 小鼠用2.5%水合氯醛（0.35 g/kg體重）腹腔注射麻醉，置于37℃保溫墊上。體視顯微鏡下剪開小鼠左側顱骨表面皮膚，用牙科水泥將一金屬棒固定在小鼠顱骨上，再借金屬棒將小鼠頭部固定于自制頭架上。用牙科鉆在左側顱骨（冠狀縫后2.5 mm，矢狀縫左2.5 mm）鉆一直徑約3 mm的圓孔，保持硬腦膜完整。直徑3 mm的圓形玻片覆蓋暴露的腦表面，用牙科水泥將圓形玻片與周圍顱骨固定，制成封閉式顱窗[5]。小鼠麻醉蘇醒后放回鼠籠，常規飼養。

1.4 慢性腦缺血模型的建立 顱窗制成2 d后，利用激光共聚焦顯微鏡經顱窗進行第1次皮層血管觀察，當日開始制作腦缺血模型（D0）。采用左側頸總動脈永久結扎結合右側頸總動脈隔日短暫結扎的改良慢性腦缺血模型。

在D0將小鼠用2.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定于37℃保溫墊上，取頸部正中切口，剪開淺筋膜，鈍性分離暴露左側頸總動脈，用4-0絲線永久結扎左側頸總動脈，縫合皮膚，蘇醒后放回鼠籠常規飼養。3 d后（D3）再次麻醉小鼠，鈍性分離右側頸總動脈，4-0絲線結扎右側頸總動脈10 min后松解絲線恢復血流，縫合皮膚，蘇醒后放回鼠籠飼養。此后2 d（D5）再次右側頸總動脈結扎10 min后恢復血流，縫合皮膚，蘇醒后放回鼠籠飼養。每次術后給予適量慶大霉素。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察皮層血管 分別于左側頸總動脈結扎前（D0）及左側頸總動脈結扎后7 d（D7），利用激光共聚焦顯微鏡通過顱窗觀察皮層血管。

已制備顱窗的小鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，頭部固定于自制小鼠頭架上。激光共聚焦顯微鏡獲取活體腦血管圖像。掃描參數：激發光波長（488 nm），10×物鏡，掃描厚度2.0 μm。使用LAS AF操作軟件，在Z軸進行連續掃描，掃描深度為皮層表面以下100 μm內。每個小鼠顱窗在10倍鏡下掃描后，選取兩個感興趣區域（region of interest，ROI），再40倍鏡下分別掃描選定的2個ROI。分別在D0和D7對同一ROI進行激光共聚焦掃描，比較腦缺血前后皮層血管變化。D0或D7顱窗模糊者剔除。

1.5.1 毛細血管密度與直徑測量 本研究中毛細血管定義為直徑＜8 μm的血管[6]。

毛細血管密度定義為每個ROI內毛細血管數目[5]。

毛細血管直徑測量：每個ROI隨機取3支毛細血管，每支毛細血管取10個不同位點測量直徑，取其平均代表該毛細血管直徑[7]。3支毛細血管直徑的平均值作為該ROI毛細血管直徑。

毛細血管又分為分支毛細血管、網狀毛細血管、集合毛細血管及細動靜脈直通支[8-9]，分別對各類毛細血管進行測量。各類毛細血管的劃分標準為：網狀毛細血管：互相吻合呈網狀，走行彎曲，柔軟，圓滑；分支毛細血管：位于網狀毛細血管上游，細動脈下游，管徑細，走行直；集合毛細血管：數個網狀毛細血管匯集而成，管徑較前粗，彎曲，途徑較短；細動靜脈直通支：細動脈與細靜脈間的直接通路[8]。

1.5.2 細動脈及細靜脈直徑測量 細動脈為小動脈的進一步分支，直徑15～30 μm，管壁較厚，走行較直。細靜脈定義為分段匯集多個毛細血管，直徑15～50 μm，管壁較薄，走行彎曲[8]。

細動脈和細靜脈直徑測量：測同一血管上10個不同位點的直徑，取其平均值為該血管直徑。

1.6 統計學分析 采用Excel軟件建立數據庫，Graph Pad 5.0軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布采用“均數±標準差”表示，兩組間比較用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。使用LAS AF軟件進行血管直徑測量與計數。

2 結果

2.1 腦缺血后毛細血管直徑的改變 缺血前（D0）和缺血后7 d（D7）毛細血管直徑分別是（6.62±0.75）μm 和（12.50±3.29）μm。D7毛細血管直徑較D0毛細血管直徑明顯擴大（t=6.415、P＜0.001），差異具有顯著性（圖1）。

2.2 腦缺血后毛細血管密度觀察 腦缺血前（D0）和腦缺血后7 d（D7），毛細血管密度分別為每ROI（11.67±1.72）個和每ROI（11.08±2.06）個，差異無顯著性（t=1.681、P=0.0583）（圖1）。

2.3 腦缺血后不同種類毛細血管直徑的改變對分支毛細血管、集合毛細血管、網狀毛細血管以及細動靜脈直通支直徑的測量結果見表1。

2.4 腦缺血后皮層細動脈與細靜脈直徑變化細動脈直徑在D0（缺血前）和D7（缺血后7 d）時分別是（12.71±2.10）μm和（13.20±3.09）μm（t=0.5533、P=0.2947）。與D0相比，D7時細動脈直徑增加了3.85%，差異無顯著性。D7時未觀察到細動脈有新生血管或出芽改變（圖2）。

細靜脈直徑在D0和D7時分別為（19.59±8.74）μm和（24.81±6.25）μm（t=3.060、P=0.0054）。與D0相比，D7時細靜脈直徑增加了26.65%，差異有顯著性。腦缺血后7 d時（D7）觀察到細靜脈走行迂曲，管壁變薄（圖2）。

表1 各類毛細血管直徑D0與D7比較（s）（μm）

表1 各類毛細血管直徑D0與D7比較（s）（μm）

注：細動靜脈直通支、網狀毛細血管：n=7，分支毛細血管、集合毛細血管：n=9

D0 D7 t P分支毛細血管 6.33 0.94 12.36 3.20 5.453 0.0003集合毛細血管 6.87 1.10 12.37 2.78 6.203 0.0001網狀毛細血管 6.37 0.52 11.41 3.10 4.168 0.0029細動靜脈直通支 6.35 0.92 13.91 6.17 3.138 0.0101

圖1 同一小鼠缺血前（D0）和缺血后7 d（D7）同一ROI內血管直徑與密度變化注：圖A、C、E分別為D0時顱窗影像、10×血管影像及40×血管影像（ROI）；B、D、F分別為D7時的顱窗影像、10×血管影像及40×血管影像（ROI）。圖示腦缺血后7 d（圖F）與缺血前（圖E）相比毛細血管直徑明顯擴張，毛細血管密度無明顯變化。c：毛細血管；ROI：感興趣區域

2.5 血管重構 比較缺血前（D0）和缺血后7 d（D7）相同區域皮層血管，發現缺血7 d后并未見到明顯新生血管或血管生芽。但是，在低倍鏡下可見小動靜脈走行改變，管徑擴大，小靜脈間吻合支的開放（圖3，紅色箭頭）。在高倍鏡下，可見毛細血管走行改變（圖3，白色箭頭）。

3 討論

腦缺血后血管形態學研究，以前多采用腦組織切片染色方法顯示血管[3]，該方法不能反映活體血管情況。近年來，小鼠封閉式顱窗已成為一種活體觀察腦血管的獨特工具，制備封閉式顱窗的小鼠可長期存活，顱窗內血管可反復觀察，適宜于研究血管的動態變化[10-11]。Tomita及Toriumi等應用封閉式顱窗對小鼠大腦皮層血流及血管形態變化進行了長期觀察[10，12]。本研究中，我們應用小鼠封閉式顱窗技術觀察了腦缺血后皮層血管形態的變化，國內尚未見到相關報道。

雙側頸總動脈結扎和單側頸總動脈結扎均為較常用的慢性腦缺血模型[13-14]。雙側頸總動脈永久結扎模型多用于大鼠慢性腦缺血研究[13]。因大鼠前循環與后循環交通支發達，雙側頸總動脈結扎后，其腦血流量可經椎動脈與Willis環代償。小鼠的交通支不發達，小鼠雙側頸總動脈結扎法死亡率高，因此單側頸總動脈結扎制備小鼠慢性腦缺血模型較普及[14]。在前期的實驗中我們發現，雙側頸總動脈結扎后小鼠3 h內死亡率為100%。本研究采用左側頸總動脈永久結扎結合右側頸總動脈隔日短暫結扎方法制作小鼠慢性腦缺血模型，腦缺血程度較單側頸總動脈結扎重，小鼠可存活（結果另文發表）。

圖2 腦缺血前后細動脈和細靜脈的變化，40×注：圖中可見腦缺血后細靜脈直徑增加，走行迂曲；細動脈直徑無明顯變化。圖A為缺血前（D0），圖B為缺血后（D7）。a：細動脈；c：毛細血管；v：細靜脈

圖3 腦缺血后血管重構注：圖A、B分別為同一顱窗缺血前及缺血后7 d時顱窗影像，紅色箭頭示吻合支開放。圖C、D分別為同一ROI缺血前及缺血后7 d時血管影像（40×），白色箭頭示毛細血管走行改變。ROI：感興趣區域

利用激光共聚焦顯微鏡和封閉式顱窗技術，本研究觀察到慢性腦缺血7 d后毛細血管直徑明顯擴張，提示毛細血管擴張可能是慢性腦缺血后腦血流恢復的機制之一。Guo等[5]研究也發現小鼠腦缺血14 d后皮層毛細血管擴張，本研究結果與之一致。

Guo[5]及Tajima等[15]分別觀察了小鼠單側頸總動脈結扎后14 d以及28 d皮層表面以下100 μm以及300 μm血管，未見到血管新生或出芽。Yoshihara等利用光照法制造小鼠局灶性腦缺血模型，觀察皮層表面以下300 μm內血管，缺血后7～28 d未發現血管新生或出芽改變[7]。不過，Masamoto等對慢性缺氧小鼠的研究中，觀察到皮層毛細血管出芽及新生現象，觀察深度為皮層表面以下300～800 μm[16-17]。本研究未觀察到腦缺血后血管新生現象，與Guo[5]、Tajima[14]及Yoshihara[7]等的研究結果一致，與Masamoto[16-17]等的研究結果不同。腦缺血后腦內是否發生血管新生各家報道不同，考慮與觀察深度及缺血時間不同有關：Guo、Tajima、Yoshihara和Masamoto的缺血時間分別為14 d、28 d、7～28 d及14～28 d，觀察深度分別為皮層表面以下100 μm以內、300 μm以內、300 μm以內及300～800 μm[5，7，15-17]。腦缺血后腦內是否發生血管新生仍需進一步研究證實。

在微循環中血液從動脈到靜脈的流動有3條通路：①血流從細動脈向分支毛細血管、網狀毛細血管、集合毛細血管、細靜脈方向流動；②血流從細動脈向分支毛細血管、毛細血管直通支、集合毛細血管、細靜脈方向流動；③血流從細動脈向動靜脈短路支、細靜脈方向流動[8]。本研究觀察到腦缺血后連接細動靜脈的動靜脈直通支較其他種類毛細血管擴張明顯，同時部分網狀毛細血管分支出現狹窄，變細，甚至消失的現象。這些改變可能為毛細血管單元在腦血流減少時發生血管重構的動態過程。

本研究首次觀察了腦缺血后毛細血管前后的細動靜脈的直徑變化，結果顯示，慢性腦缺血7 d后，細動脈與細靜脈直徑分別增加了3.85%和26.65%，提示腦缺血后細靜脈擴張較細動脈明顯。

Tajima等[15]發現小鼠慢性腦缺血時細動脈對腦血流以及血壓的調節起到主要作用。Joseph等[18]研究發現，大鼠腦血流阻力的改變與血管直徑相關，動脈擴張時阻力降低；動脈血流阻力下降時，靜脈的順應性緩慢增高。因此作者推測，當腦灌注壓降低時，細動脈發生擴張以減小血管阻力，調節腦血流量，而細靜脈在細動脈擴張后順應性增強，也發生擴張性改變。由于細靜脈的管壁較薄，在相同的缺血條件下，擴張較細動脈更顯著。

由于本研究存在觀察時間偏短，觀察皮層深度有限等不足，今后有必要延長腦缺血時間并增加觀察深度進一步研究。

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【點睛】

本研究通過慢性腦缺血模型發現慢性腦缺血后皮層血管發生毛細血管擴張（細動靜脈直通支擴張最為明顯）、細靜脈擴張等改變，上述改變可能有助于調節腦血流量。