PDE4D基因SNP83多態性與缺血性卒中預后的相關性研究

宋彥麗，王春娟，王蓬蓮，林金嬉，馬越濤，劉麗，杜萬良，劉改芬

卒中的疾病負擔巨大，而且越來越多的研究證明卒中具有明顯的遺傳傾向[1-2]。2003年冰島科學家Gretarsdottir首次證實了磷酸二酯酶4D（phosphodiesterase 4D，PDE4D）基因多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與缺血性卒中相關[3]。此后該基因成為國際學者研究的熱點，其基因多態性與不同地區、不同種族人群缺血性卒中的關系存在很大的爭議，多數研究主要關注PDE4D與卒中發病的關系，而PDE4D與卒中預后相關性的研究較少[4-7]。PDE4D基因SNP83（rs966221）位點有A、G兩個等位基因，其中A等位基因是中國人群中的野生型。本研究采用Sequenom Massyarray檢測技術檢測該位點的基因型情況，探討該位點與缺血性卒中預后的相關性。

1 對象和方法

1.1 研究對象 本研究連續入選2009年10月～2011年7月北京天壇神經內科住院的缺血性卒中患者736例。所有參與者都簽署知情同意書。本研究得到首都醫科大學附屬北京天壇醫院倫理委員會的批準。

1.2 入選標準 ①臨床診斷明確的新發急性缺血性卒中患者；②年齡＞18歲；③發病距就診日期在14 d內；④完成顱腦磁共振彌散加權成像成像（diffusion weighted imaging，DWI）檢查；⑤入院后24 h內留取血樣，提取患者白細胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）；⑥簽署參與研究的知情同意書。

1.3 排除標準 ①無癥狀和體征的靜息性缺血性卒中；②非缺血性卒中的其他腦血管事件如短暫性腦缺血發作（transient ischemic stroke，TIA）、腦出血或蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）等；③經證實的非腦血管事件；④腦血管事件發生至就診時間超過14 d；⑤未完成DWI檢查；⑥24 h內未留取血樣的患者；⑦拒絕簽署研究知情同意書。

1.4 臨床資料收集 ①該研究為單中心研究，依據入排標準連續入組發病14 d內的急性缺血性卒中患者。每例患者均通過電子病歷報告表（electronic Case-Report Form，eCRF）記錄患者的臨床信息，包括人口學信息、既往史、現病史、用藥史、家族史、體格檢查、美國國立衛生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評分、改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）評分等相關資料；通過檢驗系統數據平臺（Lis系統）收集患者的化驗信息（包括血脂、血糖、血常規、超敏C反應蛋白、抗心磷脂抗體、紅細胞沉降率、同型半胱氨酸、免疫相關指標等）；通過影像數據平臺（PACS系統）收集患者影像檢查信息，包括計算機斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、頸部血管超聲、經顱多普勒超聲（transcranial Doppler，TCD）、數字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）、12導聯心電圖、24 h動態心電圖、經胸超聲心動圖等。②隨訪：每例患者均由北京天壇醫院隨訪中心經過統一培訓的隨訪人員在卒中發病后3個月進行電話隨訪，隨訪內容包括mRS評分（以1分為界分為預后良好和預后不良[8]）、死亡、卒中復發、其他血管事件、用藥情況等。本研究的聯合終點事件定義為卒中復發、TIA復發、死亡以及其他血管事件。

1.5 基因多態性檢測 該研究使用Sequenom平臺自帶的引物設計軟件Assay Design進行引物設計，采用Sequenom Massyarray技術進行PDE4D基因SNP83（rs966221）位點基因多態性的檢測。

1.6 統計學方法 對計量資料進行正態性檢驗，對于符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示其平均水平，不符合正態分布則用中位數（四分位數間距）來表示其平均水平；計數資料用頻數和構成比來表示。計量資料如果符合正態分布，兩組間差異比較采用t檢驗，如不符合正態分布，采用秩和檢驗；計數資料比較用卡方檢驗。采用卡方檢驗分析SNP位點基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，P≥0.01認為樣本來自遺傳平衡的群體，具有較好的代表性。采用Logistic回歸模型分析不同遺傳模型下SNP83基因多態性與卒中后聯合終點事件發生（復發、死亡等聯合終點事件）和預后不良（mRS＞1分）的關聯，并計算比值比（odds ratio，OR）及95%可信區間（confidence interval，CI）。所有統計學分析用SAS 9.3軟件（SAS Institute Inc，Cary，North Carolina）進行分析，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 臨床特點 該研究按照納入和排除標準共納入736例缺血性卒中患者，3個月隨訪時59例患者失訪，失訪率為8.02%，剩余677例患者的臨床信息見表1。與未發生聯合終點事件的患者相比，發生聯合終點事件的患者年齡較大［（67.02±0.70） vs （59.98±3.35），P＜0.001］，既往心房顫動病史比例較高（9.3%vs 3.7%，P=0.048），入院時NIHSS評分較高［11（5～16） vs 5（2～9），P＜0.001］。兩組患者在性別、民族、婚姻狀況、居住方式、既往吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病史等方面差異均無顯著性（P＞0.05）。這些患者3個月隨訪時mRS評分中位數為1分（0～4分），其中預后良好（mRS≤1分）的患者330例，占48.9%。

2.2 SNP83位點基因多態性的分布情況 該位點有2例患者未檢測出基因型，檢出率為99.70%。由表2可見，該位點的最小等位基因頻率（minor allel frequency，MAF）為21%。經卡方檢驗，該位點符合遺傳平衡定律即Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.770，PHEW=0.380）。與未發生聯合終點事件患者相比，發生聯合終點事件患者中AG+GG基因型的比例較高，且差異具有顯著性（50.0% vs 36.7%，P=0.007）。而AG+GG基因型在預后良好和預后不良患者中的分布差異無顯著性（38.8% vs 36.8%，P=0.787）。

2.3 SNP83位點基因多態性與缺血性卒中預后的關系 根據以上基因型分布情況，在加性模型（AA vs AG vs GG）和顯性模型（AG+GG vs AA）下分析SNP83位點與卒中預后的相關性。由表3可見，在加性模型下，經年齡、既往心房顫動病史和入院時NIHSS評分調整后多因素Logistic分析未發現SNP83位點與聯合終點事件的發生相關（OR 1.29，95%CI 0.82～2.05）。而該位點在顯性模型下經多因素調整后與聯合終點事件發生相關，AG+GG基因型攜帶者聯合終點事件發生風險是AA基因型攜帶者的1.84倍（95%CI 1.04～3.26），因此G等位基因是卒中發病危險等位基因（表3）。同時，按照國際公認的急性卒中治療低分子肝素試驗病因分型法（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型[9]，對卒中不同亞型進行分層分析，結果并未發現該位點與不同卒中亞型后聯合終點事件的發生相關。在加性和顯性模型下，經年齡、既往心房顫動病史和入院時NIHSS評分調整后Logistic分析均未發現該位點與卒中預后不良的相關性，并且也未發現其與不同亞型卒中預后不良的相關性（表4）。

表1 有無聯合終點事件兩組患者基線信息特征

表2 SNP83位點基因型在不同組別中的分布情況

表3 SNP83位點基因多態性與卒中及其不同亞型聯合終點事件發生的相關性

3 討論

PDE4D基因位于人類染色體5q12上，長度大約為1.6 Mb，至少含21個外顯子和22個內含子，是一類能特異性水解環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），使其轉變成失活性的單核苷酸的關鍵酶，這是cAMP和cGMP降解的唯一途徑[10]。cAMP廣泛存在于體內各種細胞中，包括血管平滑肌細胞、內皮細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞，在信號轉導和生理反應的調控中起著重要作用。研究認為PDE4D的表達增加可導致cAMP的活性降低，進而引起血管平滑肌細胞增生和遷移以及血管受損處局部炎癥反應加劇，促進動脈粥樣硬化的形成，導致動脈粥樣斑塊的易損性增加[11-12]。

目前關于PDE4D基因與缺血性卒中發病的相關性的研究較多。2003年來自冰島人群的研究[3]，表明PDE4D基因的SNP41、SNP45、SNP56、SNP83、SNP87、SNP89與缺血性卒中，尤其是頸動脈源性和心源性卒中明顯相關。Saleheen等[13]在包括200例缺血性卒中患者和250例對照的巴基斯坦人群中驗證了該基因的SNP83（rs966221）與缺血性卒中的相關性。同時Yadav等[14]在南亞人群中進行的meta分析，也發現PDE4D基因的SNP83位點與缺血性卒中發病相關。但Kuhlenbumer等[15]在德國人群中的研究未發現PDE4D基因與缺血性卒中的關聯。Lovkvist等[16]在瑞典西部和南部人群進行的meta分析，亦未發現PDE4D基因SNP45位點與缺血性卒中的相關性。可見目前研究發現，PDE4D基因多態性與缺血性卒中的相關性在不同地區、不同人群中的結果不一致，甚至是相反的[4，17-19]，這可能與不同地區、不同種族人群基因分布情況的差異性有關。

表4 SNP83位點基因多態性與卒中及其不同亞型預后不良的相關性

He Ying等[20]在中國河南人群中研究該基因與中國人群缺血性卒中的相關性，發現PDE4D基因的SNP87（rs918592）與該人群缺血性卒中相關（OR 1.87，95%CI 1.25～2.80），尤其是男性（OR 2.13，95%CI 1.25～3.63）。同時，他們在中國年輕漢族人群（18～45歲）中進行的病例對照研究[21]，顯示該位點的A等位基因和AA基因型明顯增加中國年輕人群卒中的風險（調整OR，95%CI分別為1.45，1.10～1.91；2.19，1.23～3.90）；同時也發現該基因位點的rs2910829的T等位基因和TT基因型與中國年輕人群缺血性卒中的發生明顯相關（調整OR，95%CI分別為2.75，1.97～3.84；6.67，2.58～17.22）。但這兩項研究都未按照TOAST分型進行亞型分析。Shao等[22]在中國西南地區對459例卒中患者和462例健康對照人群進行的研究并沒有發現SNP45、SNP83、SNP87與缺血性卒中的關聯（OR和95%CI分別為1.002，0.99～1.01；0.87，0.69～1.10；0.93，0.73～1.19），也未發現這些基因與按照TOAST分型的不同卒中亞型的相關性。為進一步驗證該基因在中國人群中與缺血性卒中的相關性，Liu等[6]對中國人群研究的meta分析發現SNP83在顯性和隱性模型下均與缺血性卒中發生相關，并且亞型分析發現該位點與大動脈粥樣硬化性卒中的相關性明顯，這與最近Yan Yan等[5]的meta分析結果是一致的。在此基礎上，本研究探索了PDE4D基因的SNP83位點與缺血性卒中預后（復發、死亡等聯合終點事件）的相關性，結果發現該位點的AG+GG基因型與缺血性卒中后聯合終點事件發生相關（調整OR 1.95，95%CI 1.10～3.47）。由于基因與卒中不同亞型的遺傳度是不同的[23-24]，因此對卒中亞型進行了分層分析。結果發現該位點AG+GG基因型可能與大動脈粥樣硬化性卒中后聯合終點事件的發生相關（OR 2.10，95%CI 0.95～4.67），但差異無顯著性，這可能與本研究樣本量不夠大有關，有待于進一步擴大樣本量繼續探討。該研究亦未發現，該位點與小動脈閉塞性卒中和心源性卒中預后相關，這可能是由于該研究的樣本量較小，導致某些基因型在亞組的分布較少而影響研究結果，也可能因為卒中不同亞型的發病機制不同所致[9，25]，這有待進一步擴大樣本量繼續研究。

本研究發現PDE4D基因SNP83位點與缺血性卒中預后相關，這將為卒中的預防探索新的預防、診治方案提供思路。但由于該研究為單中心研究，且樣本量有限，導致某些基因型頻率較少，因此有待大樣本、多中心的研究來進一步證實，以便得出更可靠的結論。

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【點睛】

該文章研究PDE4D基因SNP83多態性與缺血性卒中預后的相關性，發現其AG/GG基因型與卒中后聯合終點事件發生相關。