維生素D受體TaqⅠ、ApaⅠ基因多態性與昆明漢族2型糖尿病腎病的相關性研究

韓 睿 董 霞 蘇炳馳 楊薇 劉 華 宋滇平.昆明醫學院第一附屬醫院糖尿病科，云南昆明 65003；.昆明醫學院第一附屬醫院檢驗科，云南昆明 65003

維生素D受體TaqⅠ、ApaⅠ基因多態性與昆明漢族2型糖尿病腎病的相關性研究

韓 睿1董 霞1蘇炳馳1楊薇1劉 華2宋滇平1
1.昆明醫學院第一附屬醫院糖尿病科，云南昆明 650032；2.昆明醫學院第一附屬醫院檢驗科，云南昆明 650032

目的研究云南昆明地區漢族2型糖尿病患者維生素D受體基因TaqⅠ（rs731236）、ApaⅠ（rs7975232）與2型糖尿病腎病（DN）發病的相關性。 方法運用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術，對昆明漢族108例DN及180例糖尿病不伴腎病（NDN）患者的維生素D受體（VDR）基因TaqⅠ、ApaⅠ基因多態性進行檢測，分析并比較其臨床資料、基因型頻率、等位基因頻率等。結果NDN患者TaqⅠ位點的基因型頻率分別為T/T 88.89%、T/t+t/t 11.11%,等位基因頻率分別為T 93.33%、t 6.67%，DN患者TaqⅠ位點的基因型頻率分別為T/T 94.44%、T/t+t/t 5.6%，等位基因頻率分別為T 97.22%、t 2.78%；NDN患者ApaⅠ位點的基因型頻率分別為a/a 45.60%、A/A+A/a 54.40%，等位基因頻率分別為A 32.22%、a 67.78%，DN患者ApaⅠ位點的基因型頻率分別a/a 51.85%、A/A+A/a 48.15%，等位基因頻率分別為A 25.00%、a 75.00%。兩組患者ApaⅠ、TaqⅠ位點的基因型頻率及等位基因頻率比較，差異均無統計學意義 （P＞0.05）。②ApaⅠ位點的aa和Aa基因型是DN發生的危險因素（OR=6.313、5.525，P=0.018、0.034）。 結論aa和Aa基因型是DN發生的危險因素。

2型糖尿病；維生素D受體；基因多態性；糖尿病腎病

流行病學資料表明，約40%的糖尿病患者發生糖 尿病腎病（DN）[1]，而且DN的發生與血糖水平無關。Zhang等[2]研究表明，維生素D受體（VDR）基因敲除的糖尿病小鼠更易發展為嚴重的蛋白尿和腎小球硬化，提示VDR基因與DN的發生有關。本研究探討發生DN的危險因素及其易感基因，并從分子角度探討TaqⅠ、ApaⅠ位點多態性與DN的關系，為進一步探索DN的危險因子和篩查易感基因提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇昆明醫學院第一附屬醫院 （以下簡稱 “我院”）2010年11月～2012年8月住院治療的2型糖尿病（T2DM）患者288例，男150例，女138例；年齡22～75歲，平均（52.94±11.94）歲。所有對象均無血緣關系，無其他自身免疫性疾病病史。該研究經我院倫理委員會通過，患者知情同意并簽署知情同意書。T2DM診斷參照1999年WHO診斷標準。參考美國糖尿病協會推薦的DN診斷標準：隨機尿白蛋白肌酐比值（albumin creatinine ratio，ACR）≥30 μg/mg即診斷為DN，隨機尿ACR＜30 μg/mg為糖尿病不伴腎病（NDN）。排除DN合并發熱、尿路感染、尿路結石、急慢性腎炎、腎病綜合征、惡性腫瘤以及伴有大血管病變等病史者。且所有患者均給予口服降糖藥或接受胰島素治療，近3個月內未接受葉酸、維生素B12治療。

1.2 研究指標

采用問卷調查，包括人口學資料、個人疾病史、心腦血管疾病史等，采用標準、規范的方法測量研究對象的坐位血壓、身高、體重、腰圍、臀圍，并計算體重指數（BMI）、腰臀比（WHR）。兩組患者取空腹及餐后2 h靜脈血，測定血糖、血脂、胰島素、糖化血紅蛋白等。以上測定在日本奧林巴斯AU5400型全自動生化分析儀、FT-630G儀器上進行，由專人負責，并進行質量控制。

建立了校內實習基地，依托教學基地，加強將專業理論知識轉化為解決工作實際問題的能力，可以熟悉制造業、商業企業等工藝操作實際過程，彌補會計基礎和財務管理課程理論課表達中的不足，讓學生通過真實情景和過程提前進入工作環境。

1.3.1 DNA提取 采集研究對象清晨空腹肘部靜脈血2 mL，用全血DNA抽提試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）提取血液基因組DNA，應用Eppendorf AG分光光度計（德國）進行DNA純度/濃度測定后，置于-80℃保存備用。

[3]Vandevyver C，Wylin T，Cassiman JJ，et al.Influence of the vitamin D receptor gene alleles on bone mineral density in postmenopausal and osteoporotic women [J].J Bone Miner Res，1997，12（2）：241-247.

2.3 DN相關危險因素的Logistic回歸分析

1.3.4 ApaⅠ位點、TaqⅠ位點核苷酸直接測序 為驗證酶切結果，筆者將PCR產物進行直接測序（送北京百泰克生物技術有限公司檢測），酶切結果與直接測序結果一致，見圖1、2。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，均檢驗其正態性，若為正態分布且方差齊則采用t檢驗，若不為正態分布，則采用秩和檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。相關性分析采用Logistic多元回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.6 基因突變分析 對144例入選患者進行基因突變檢測，共檢測到33種突變基因，DNMT3A和IKZF1突變在CD56+組中分別為0例和6例(75.00%)，而在CD56-組分別為11例(100.00%)和2例(25.00%)，差異有統計學意義(χ2=4.442、4.781；P=0.035、0.029；P<0.05)；除去以上2種突變基因，其他31種突變基因在CD56+組和CD56-組組間的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表6。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料比較

兩組在年齡、BMI、WHR、血糖、血脂、胰島素抵抗指數方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）。DN組糖尿病病程顯著長于NDN組，SBP高于NDN組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

兩組患者ApaⅠ、TaqⅠ基因型以及等位基因頻率比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 兩組患者ApaⅠ、TaqⅠ基因型以及等位基因頻率比較

采用儀器自帶鎘標準溶液對電化學法進行準確性檢定，測得峰電位為-785mV，鎘含量為0.327mg/kg，符合儀器預設范圍。

1.3.3 酶切鑒定基因型 PCR擴增產物分別用ApaⅠ、TaqⅠ限制性核酸內切酶（由MBI Fermentas公司提供）酶切后，置于2%的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。結果示：ApaⅠ位點中純合子AA基因型740 bp；純合子aa基因型520 bp和220 bp；雜合子Aa基因型740 bp、520 bp、220 bp。TaqⅠ位點中純合子TT基因型454 bp；雜合子Tt基因型454 bp、293 bp、161 bp；純合子tt基因型293 bp、161 bp。

以是否并發DN作為因變量，余指標為自變量行Logistic回歸分析。結果提示SBP和ApaⅠ位點的aa、Aa基因型是發生DN的危險因素。見表3。

3 討論

近年來發現DN的發生與維生素D的缺乏有關。在DN患者中，維生素D不足的發生率高達77.5%[5]。而維生素D是通過VDR來發揮其生物活性。故VDR基因的差異有可能是導致DN的主要原因之一，故DN的發生與VDR基因遺傳多態性有關。迄今為止，已發現VDR存在多種單核苷酸多態性（SNPs），且每種突變的發生頻率在人群中存在一定的地域、種族差異[6]。與糖尿病相關的SNPs主要集中在FokⅠ（rs2228570）、BsmⅠ（rs1544410）、ApaⅠ（rs797 5232）、TaqⅠ（rs731236）這4種基因。對于VDR基因四個常見變異位點而言，國內外均有研究表明，外顯子起始密碼子的突變位點（FokⅠ）等位基因頻率在病例組與對照組之間的差異有統計學意義，F等位基因是DN的易感基因[7-8]，而BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點的基因型和等位基因型的差異一直存在爭議[9-10]。另有研究顯示[11]，在DN和NDN患者中，VDR基因在TaqⅠ外顯子9的等位基因中差異顯著，TaqⅠ基因及其功能多態性與DN的發病有關。高水平的1，25（OH）2D3能改善DN的進展，但這種聯系能被FokⅠ多態性改變[12]。本研究發現，DN組和NDN組患者ApaⅠ位點及TaqⅠ位點的等位基因和基因型頻率比較差異均無統計學意義（P＞0.05），但進一步的回歸分析顯示，ApaⅠ位點的aa和Aa基因型可能是發生DN的危險因素。其可能原因為ApaⅠ位點在VDR基因第9內含子上，其突變影響VDR mRNA的穩定性，從而影響血管緊張素系統的活性，參與DN的發生。但還需進一步驗證。故進一步研究VDR基因多態性與DN的關系對探索該基因與DN可能的發病機制具有重要意義。

首先，理想一致于信念。理想信念是具備中國特色的一個固定用法，我們絕對不能單獨強調其中之一，或者以偏概全。理想是面向未來，信念直指現在。共產黨員的追求，既是對未來的追求，也是對現實的追求。理想是信念的前提，信念是理想的基礎。就當前來說，共產主義理想是中國特色社會主義信念的前提，中國特色社會主義信念是共產主義理想的基礎。堅持二者的統一性，不僅可以培養中共黨員實現共產主義理想的熱情和積極性，而且可以使他們堅定中國特色社會主義信念，促使他們在工作中勤奮踏實，自覺提高自身本領，穩步邁向共產主義。

[2]Zhang Z，Sun L，Wang Y，et al.Renoprotective role of the vitamin D receptor in diabetic nephropathy[J].Kidney Int，2008，73（2）：163-171.

1.3.2 PCR擴增 擴增所使用的引物：①ApaⅠ位點[3]：上游引物5＇-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3＇，下游引物5＇-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3＇。②TaqⅠ位點[4]：上游引物5＇-CAGAGCATGGACAGG GAG-3＇，下游引物5＇-AGGAGAGGCAGCGGTACTG-3＇。PCR擴增條件：①ApaⅠ位點：共35個循環：94℃預變性3 min，然后94℃變性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，反應完成后，72℃再延伸6 min。②TaqⅠ位點：共35個循環：94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s。反應完成后，72℃再延伸5 min。取PCR擴增產物進行2%瓊脂糖泳后，以50 bp DNA Ladder Marker作為分子量參照物，用紫外凝膠成像系統拍照（ApaⅠ位點PCR產物片段長度為740 bp，TaqⅠ位點PCR產物目的片段長度為454 bp）。

眾所周知，農村經濟合作組織是獨立的法人實體，因此，在發展過程中應該具有獨立的法人資格。在此種情況下，我國農業部門要想讓農村經濟合作組織發揮出應有的作用，就需要提高農村經濟合作組織的社會地位，讓其能夠與銀行組織、政府部門等其他組織進行有效合作，從而有效縮小生產經營風險，提高勞動生產率，潛移默化中推動我國農業實現可持續發展，提高農民的經濟收入。

1.3 研究方法

[1]劉志紅.糖尿病腎病的遺傳背景研究[J].中華內科雜志，2002，41（8）：561-562.

[4]Vupputuri MR，Goswami R，Gupta N，et al.Prevalence and functional significance of 25-hydroxyvitamin D deficiency and vitamin D receptor gene polymorphisms in Asian Indians[J].Am J Clin Nutr，2006，83（6）：1411-1419.

[5]Zang L，Fu P，Huang YQ，et al.Vitamin D deficiency and carotid artery intima-media thickness and coronary calcification in patients with diabetic nephropathy[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2012，43（3）：420-424，450.

將PBL教學法引入高等師范院校水文學教學中，以問題為基礎，以學生為主體，以教師為導向的啟發式教育，以培養學生的能力為教學目標，發揮問題對學習過程的指導作用，調動學生的主動性和積極性．PBL教學模式的應用可以讓學生在一個真實的情境中對驅動問題展開探究，從而解決問題，并在探究過程中學習及應用學科思想．同時，學生要創制出一套能解決問題的可行產品，這樣也可以鍛煉彼此之間的團隊協作能力，作為課堂學習的成果公開展示答辯，在展示答辯過程中培養學生的發問習慣，提升學生的講解思辨能力．PBL教學法作為一種有效提升學生綜合素質能力，提升學生學習興趣的教學模式可以在高等院校水文學教學中推廣．

秦鐵崖聽喬十二郎介紹自己是他表姐夫的好朋友，既感到滑稽，也感到溫暖，隨即對老太醫說：“不用客氣，飲茶清談，也很不錯。”

[6]Van Belle TL，Gysemans C，Mathieu C.Vitamin D and diabetes：the odd couple[J].Trends Endocrinol Metab，2013，24（11）：561-568.

[7]常永麗.維生素D受體FokⅠ基因多態性與內蒙古地區蒙漢人群糖尿病腎病的相關性研究[J].醫學綜述，2012，18（8）：1243-1245.

[8]Vedralova M，Kotrbova-Kozak A，Zeleznikova V，et al.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and parathyroid hormonegeneinthedevelopmentand progressionofdiabetes mellitus and its chronic complications，diabetic nephropathy and non-diabetic renal disease[J].Kidney Blood Press Res，2012，36（1）：1-9.

[9]Zhou TB，Jiang ZP，Li AH，et al.Association of vitamin D receptor FokⅠ（rs2228570），TaqⅠ（rs731236）and ApaⅠ（rs7975232）gene polymorphism with the risk of chronic kidney disease[J].J Recept Signal Transduct Res，2014，22：1-8.

[10]Liu ZL，Liu L，Chen X，et al.Associations study of vitamin D receptor gene polymorphisms with diabetic microvascular complications：a meta-analysis[J].Gene，2014，546（1）：6-10.

采用SPSS 19.0軟件對數據進行分析處理，計量資料以（均數±標準差）表示，采用t檢驗；計數資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

[11]Nosratabadi R，Arababadi MK，Salehabad VA，et al.Polymorphisms within exon 9 but not intron 8 of the vitamin D receptor are associated with the nephropathic complication of type-2 diabetes[J].Int J Immunogenet，2010，37（6）：493-497.

[12]Yokoyama K，Nakashima A，Urashima M，et al.Interactions between serum vitamin D levels and vitamin D receptor gene FokⅠpolymorphisms for renal function in patients with type 2 diabetes[J].PloS one，2012，7（12）：e51171.

Association between TaqⅠ ,ApaⅠ of Vitamin D receptorgene polymorphism and type 2 diabetic nephropathy of the Han Nationality in Kunming

HAN Rui1DONG Xia1SU Bingchi1YANG Wei1LIU Hua2SONG Dianping1
1.Department of Diabetes,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Yunnan Province,Kunming 650032,China;2.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Yunnan Province,Kunming 650032,China

ObjectiveTo investigate the relationship between TaqⅠ(rs731236),ApaⅠ(rs7975232)and type 2 diabetic nephropathy of the Han Nationality in Yunnan area of Kunming.Methods PCR-RFLP technique was used to detected TaqⅠ,ApaⅠof Vitamin D receptor gene polymorphism in 108 patients with diabetic nephropathy and 180 patients without nephropathy.The clinical data,genotype frequencies,allele frequencies were analyzed and compared. Results①Genotype frequency of TaqⅠ loci in NDN patients were T/T 88.89%and T/t+t/t 11.11%,allele frequency were T 93.33%and t 6.67%,respectively,genotype frequency of TaqⅠloci in DN patients were T/T 94.44%and T/t+ t/t 5.6%,allele frequency were T 97.22%and t 2.78%,respectively;genotype frequency of ApaⅠ loci in NDN patients were a/a 45.60%,A/A+A/a 54.40%,allele frequency were A 32.22%and a 67.78%,respectively,,genotype frequency of ApaⅠloci loci in DN patients were a/a 51.85%and A/A+A/a 48.15%,allele frequency were A 25.00%and a 75.00%,respectively.Comparison between two groups of patients with ApaⅠ,TaqⅠloci of genotype frequency and allele frequency,there were no statistically significant difference (all P＞0.05).②aa and Aa genotype in ApaⅠ were risk factors of DN(OR=6.313,5.525;P=0.018,0.034).Conclusion aa and Aa genotypes are risk factors of DN.

Type 2 diabetes;Vitamin D receptor;Gene polymorphism;Diabetic nephropathy

R744.51

A

1673-7210（2015）03（c）-0069-04

2014-12-25本文編輯：衛 軻）

云南省科技計劃項目（編號2009CD086）；云南省教育廳科學研究基金項目（編號2013Y286）；云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項基金項目（編號2014 FB029）。