Doxycycline對胃癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響

趙然 王學(xué)哲 李紅 王鵬

Doxycycline對胃癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響

趙然 王學(xué)哲 李紅 王鵬

目的探討多西環(huán)素(Doxycycline)對胃癌SGC7901細(xì)胞抑制增殖和侵襲能力的影響, 分別檢測跨膜受體蛋白(Notch-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表達(dá)的情況, 并對其可能的機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法通過對胃腺癌SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù), 分別以終濃度0、5、10、15、20 μg/ml的Doxycycline作用于人胃癌細(xì)胞SGC7901, 用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT 法)檢測Doxycycline對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞抑制率；采用瑞士姬姆薩混合染色液進(jìn)行染色, 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞法檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡率及增殖周期的影響；Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力的變化；Western blot法檢測Notch-1, MMP-9蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果Doxycycline能夠誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞SGC7901的凋亡, 存在時間-劑量依賴性(P＜0.01)；能夠改變細(xì)胞周期的分布, 隨著Doxycycline濃度的增加, G0/G1期細(xì)胞所占比例增加, S期細(xì)胞比例減少, G2/M期細(xì)胞比例減少；隨著藥物濃度的增加, Notch-1和MMP-9蛋白表達(dá)增加(P＜0.01)。結(jié)論上調(diào)Notch-1可能是Doxycycline能夠抑制人胃腺癌SGC7901細(xì)胞的增殖和侵襲的機(jī)制之一。

多西環(huán)素；胃癌；增殖；侵襲；跨膜受體蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

胃癌在我國居惡性腫瘤第三位, 據(jù)全國腫瘤登記地區(qū)數(shù)據(jù)表明, 2009年胃癌發(fā)病率為36.21/10萬, 死亡率為25.88/10萬。腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡平衡失調(diào)導(dǎo)致了腫瘤的生成。臨床上多選擇用抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡兩種方法來達(dá)到腫瘤的治療目的［1］。Doxycycline屬于四環(huán)素族抗生素, 除具有抗菌性能, 大量醫(yī)學(xué)研究證明, 對腫瘤細(xì)胞也具有細(xì)胞毒活性和抗增殖作用。Doxycycline的優(yōu)點是持續(xù)的時間較長、毒性相對較少, 有較強(qiáng)特異性, 對各種癌細(xì)胞均有細(xì)胞毒性和抗增殖作用, 它已經(jīng)被證明能夠抑制細(xì)胞的增殖和侵襲以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。

1 材料與方法

1.1 材料 胃腺癌SGC7901細(xì)胞由北京大學(xué)人民醫(yī)院提供。

1.2 藥物與試劑 MTT及凋亡檢測試劑盒 (北京賽馳生物公司)、胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、Doxycycline(Sigma公司)、Notch-1抗體(ABCAM公司)、瑞士姬姆薩混合染色液(美國BD公司)、MMP-9抗體(Santa Cruz公司)、碘化丙啶(PI)染色液、70%乙醇。

1.3 方法 37℃溫度下, 飽和濕度, 5%CO2的條件下, 將胃癌SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于 10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用MTT法。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞, 用0.25%胰酶制備成單細(xì)胞懸液, 調(diào)整密度為1×106/ml, 接種到96孔培養(yǎng)板, 每孔接種100 μl。根據(jù)濃度不同分為五組:藥物終濃度為0、5、10、15、20 μg/ml組。加入RPMI 1640培養(yǎng)基作為對照組, 每一濃度設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h, 用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處測定吸光度值, 細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組平均 OD 值/對照組平均OD值)× 100%。

Western blot檢測MMP-9的表達(dá)：將各組細(xì)胞在培養(yǎng)7 h后進(jìn)行收集, 分別提取總蛋白, 進(jìn)行聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳, 轉(zhuǎn)膜, 10%脫脂牛奶室溫封閉3 h, 加入抗MMP-9(1：500)、和β-actin (1∶200)4℃ 下孵育, 搖床過夜, 加二抗室溫下孵育2 h, 用化學(xué)發(fā)光劑顯色, 自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像, 顯示蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及重復(fù)測量資料的方差分析, 組間多重比較采用SNK-α檢驗, 相關(guān)性比較采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

Doxycycline對細(xì)胞增殖抑制的影響 在24、48、72 h對細(xì)胞增殖抑制率：①0 μg/ml組：為基線對照均為0；②5 μg/ml組：(20.01±1.55)、(28.98±1.72)、(35.02±1.27)%；③10 μg/ml組：(32.02±1.29)、(42.09±1.45)、(48.92±1.34)%；④15 μg/ml組：(48.72±1.63)、(53.98±1.09)、(60.24±1.06)%；⑤20 μg/ml組：(54.92±1.45)、(60.15±1.23)、(68.92±1.63)%。各組濃度的Doxycycline對胃癌細(xì)胞的增殖都有抑制作用,并且這種抑制作用與Doxycycline存在著時間-劑量相互關(guān)系, 即隨著Doxycycline藥物濃度的增大和作用時間的延長, Doxycycline對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用更加明顯。各濃度組細(xì)胞增殖抑制率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；相同作用時間下, 各濃度組之間細(xì)胞增殖抑制率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；相同濃度作用下, 不同作用時間的細(xì)胞增殖抑制率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；24 h、48 h、72 h的IC 50值分別為12.86、10.88、9.07。

3 討論

胃癌在我國居各種癌癥死亡的第三大病因。腫瘤細(xì)胞的過度增殖與阻礙凋亡, 直接導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞生命的延長。腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡平衡失調(diào)導(dǎo)致了腫瘤的生成。臨床上多選擇用抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡兩種方法來達(dá)到腫瘤的治療目的。Doxycycline對各種癌細(xì)胞均有細(xì)胞毒性和抗增殖作用［3］, 能夠抑制細(xì)胞的增殖和侵襲以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。原發(fā)和繼發(fā)腫瘤的生長調(diào)節(jié)效應(yīng), 促進(jìn)新生血管形成和調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附等［5］。

綜上所述, Doxycycline對于胃癌的治療有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用潛力, Notch1的激活可能為機(jī)制之一。

［1］鄭朝旭, 鄭榮壽, 陳萬青.中國2009年胃癌發(fā)病與死亡分析.中國腫瘤, 2013, 22(5):327-332.

［2］許敏, 李紅.強(qiáng)力霉素對胃癌細(xì)胞增殖及Notch1、MMP-9表達(dá)的影響.天津醫(yī)藥, 2014, 42(6):533-535.

［3］謝兆蘭, 朱尤慶, 林小玲, 等.強(qiáng)力霉素對胃癌細(xì)胞SGC-7901基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2表達(dá)的影響.胃腸病學(xué), 2006, 11(4):202-206.

［4］劉曼麗, 鄒文進(jìn), 黃明漢, 等.多西環(huán)素對體外培養(yǎng)的牛角膜肌成纖維細(xì)胞增生的影響.中華實驗眼科雜志, 2013, 31(5): 428-433.

［5］劉斌, 徐小方, 關(guān)素敏, 等. PTEN基因聯(lián)合多西環(huán)素對黏液表皮樣癌細(xì)胞侵襲的抑制作用.口腔醫(yī)學(xué)研究, 2010, 26(5):617-619.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.21.027

2015-08-04］

121001 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科

王學(xué)哲