Notch1蛋白在兒童急性白血病中的表達(dá)及意義

趙曉莉，錢(qián)新宏，潘凱麗，李迎俠，王英娟

(1.陜西省第四人民醫(yī)院兒科，陜西 西安 710043；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科，陜西 西安 710032)

Notch1蛋白在兒童急性白血病中的表達(dá)及意義

趙曉莉1，錢(qián)新宏2，潘凱麗2，李迎俠2，王英娟2

(1.陜西省第四人民醫(yī)院兒科，陜西 西安 710043；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科，陜西 西安 710032)

目的 探討兒童急性白血病(AL)骨髓細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)及其與免疫分型的關(guān)系。方法 收集2009年10月至2011年11月初診的42例AL患兒和22例正常或非惡性血液病兒童(對(duì)照組)骨髓涂片，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)骨髓中Notch1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 42例AL患兒中，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)32例，其急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)25例，急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)7例；急性髓細(xì)胞白血病(AML)10例。Notch1蛋白在兒童急性白血病中的表達(dá)情況，AML組表達(dá)率為60.0%(6/10)，T-ALL組為71.4%(5/7)，B-ALL組為28.0%(7/25)，對(duì)照組為13.6%(3/22)。與對(duì)照組相比，AML組和T-ALL組Notch1蛋白表達(dá)率均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為7.311、8.878，均P<0.05)；B-ALL組Notch1蛋白表達(dá)率亦高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T-ALL患兒和B-ALL組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.400，P<0.05)。Notch1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR依次升高，HR組高于LR組及MR組，但組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 Notch1蛋白在不同類(lèi)型的兒童AL中表達(dá)有明顯差異，T-ALL發(fā)病與異常的Notchl信號(hào)有關(guān)。Notch1信號(hào)可能在AL中起著重要作用，但需要進(jìn)一步收集資料論證。

急性白血病；Notch1蛋白；免疫細(xì)胞化學(xué)；兒童

急性白血病(acute leukemia，AL)是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的惡性腫瘤，起源于造血系統(tǒng)的惡性增生，是兒童的主要死亡原因之一。近年來(lái)，兒童急性白血病患兒數(shù)呈顯著提高，雖然經(jīng)合理的規(guī)范化化療，目前急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的治愈率已達(dá)到80%左右[1]，但仍然有很多患兒對(duì)化療反應(yīng)不佳。研究顯示，急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)的發(fā)生與Notch1蛋白(Notch1)密切相關(guān)[2]。目前對(duì)Notch1在乳腺癌、食管癌等實(shí)體瘤及成人各型白血病特別是T-ALL中的作用研究較多，Notch1在兒童AL中的報(bào)道甚少。成人作為成熟期的個(gè)體，各種類(lèi)型白血病的研究結(jié)果是否與處于生長(zhǎng)發(fā)育期的兒童相一致？因此采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)AL患兒骨髓液中的Notch1蛋白表達(dá)，期待能對(duì)兒童白血病的靶向治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

實(shí)驗(yàn)組(42例)為西京醫(yī)院兒科2009年10月至2011年11月收治的患兒，全部符合2006年參考文獻(xiàn)[2-3]的兒童急性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)。42例初診的AL兒童中，ALL 32例，急性髓細(xì)胞白血病(AML)10例。ALL組中，男22例，女10例；LR 10例，MR 14例，HR 8例；T-ALL 7例，急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)25例；年齡2～14歲，中位年齡4歲。AML組中，男6例，女4例；AML-M2 5例，AML-M3 3例，AML-M5 2例；年齡2.6～10歲，中位年齡5歲。42例患兒中有40例接受治療，2例放棄治療。接受治療的患兒均按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)規(guī)范化治療[3-4]。

對(duì)照組為西京醫(yī)院同期收治的22例確診后為非惡性血液病兒童，其中血小板減少性紫癜16例，再生障礙性貧血4例，其他2例。其中男12例，女10例；年齡1～14歲，中位年齡6.5歲。

所有兒童的骨髓樣本采集均征得患兒家長(zhǎng)或/和患兒本人同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫分型及融合基因檢測(cè)

所有AL患兒在初發(fā)時(shí)采集骨髓液1～1.5mL使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫分型，根據(jù)白血病細(xì)胞表面抗原表達(dá)類(lèi)別分為T(mén)-ALL、B-ALL、AML；采集骨髓液3mL進(jìn)行BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測(cè)，所有AL患兒BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測(cè)呈陰性。

1.2.2 試劑

兔抗人Notch1多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。免疫組化染色試劑盒(HistostainTM-Plus Kits)，濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidin，DAB)試劑盒(ZLI-9032)，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫分型標(biāo)本來(lái)源于AL患兒初診時(shí)的骨髓細(xì)胞，免疫分型用單克隆抗體購(gòu)自BD公司。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

質(zhì)量控制：陰性對(duì)照：以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，其余所加試劑及步驟一致。

1.2.3.1標(biāo)本采集 用干凈的載玻片將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兒童骨髓液約0.3mL推平在防脫載玻片上，骨髓涂片要厚薄均勻，頭、體、尾分明，室溫下放置40min，自然晾干，每1份標(biāo)本涂片2張，一張用于滴加Notch1抗體，另一張用于做陰性對(duì)照。把骨髓涂片置37℃孵育箱24h，有助于待檢細(xì)胞貼壁。用4%多聚甲醛室溫孵育固定30min，常溫下自然干燥后，-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2.3.2 Notch1蛋白檢測(cè) 取出-20℃冰箱保存的骨髓涂片，室溫放置15min。用0.2%TritonX-100，透化2～5min。PBS沖洗3次，每次3min(每次沖洗時(shí)用滴管輕柔操作，避免備檢細(xì)胞脫片)。加1滴3%H2O2去離子水孵育10min(孵育均在濕盒內(nèi))，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用PBS沖洗3次，每次3min。滴加試劑A(封閉用山羊血清)，室溫孵10min。倒掉或者吸干液體。每張玻片上加1:200稀釋的一抗或者PBS液，4℃冰箱過(guò)夜。用PBS沖洗3次，每次3min。每張玻片上滴加試劑B(生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG)，室溫孵育15min。PBS沖洗3次，每次3min。每張玻片上加1滴試劑C(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，S-A/HRP)，室溫孵育15min。PBS洗滌3次，每次3min。每張玻片上加一滴新鮮配制的DAB顯色液，常溫避光顯色2～15min，在顯微鏡下觀(guān)察顯色情況。1×PBS沖洗玻片，終止顯色。蘇木素復(fù)染襯染胞核：蘇木素染色液染色5～10min，根據(jù)染色結(jié)果調(diào)整時(shí)間。PBS沖洗終止顯色，晾干。脫水，透明，中性樹(shù)膠封片：95%乙醇脫水2min；換用新鮮95%乙醇再脫水2min；二甲苯透明5min；換用新鮮二甲苯，再透明5min；用中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀(guān)察、拍照，計(jì)數(shù)Notch1受體蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，具體見(jiàn)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 結(jié)果判斷

顯微鏡下，Notch1蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞膜/細(xì)胞漿/細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色物質(zhì)，主要定位于細(xì)胞漿與細(xì)胞膜，陽(yáng)性細(xì)胞散在分布；陰性對(duì)照，細(xì)胞的細(xì)胞漿及細(xì)胞核全部呈藍(lán)色。每例高倍鏡視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)白血病細(xì)胞，按照參考文獻(xiàn)的方法稍作改動(dòng)，從細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占同類(lèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行綜合評(píng)分[5]：細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分，棕黃色計(jì)1分，棕褐色計(jì)2分；Notch1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，Notch1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～10%為1分， 10～30%為2分，>30%為3分，兩項(xiàng)結(jié)果總分>2分為陽(yáng)性，<2分為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0中文版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)用百分率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性白血病兒童Notch1蛋白的表達(dá)

Notch1蛋白在兒童急性白血病中的表達(dá)情況：AML組表達(dá)率為60.0%(6/10)，T-ALL組為71.4%(5/7)，B-ALL組為28.0%(7/25)，對(duì)照組為13.6%(3/22)，見(jiàn)圖1。AML組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.311，P<0.05)，T-ALL組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.878，P<0.05)，B-ALL與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.481，P>0.05)，ALL組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.700，P>0.05)。T-ALL與B-ALL患兒相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.400，P<0.05)。Notch1受體蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的顯微鏡下顯示見(jiàn)圖2。

圖1 Notch蛋白在AL各組和對(duì)照組表達(dá)率比

Fig. 1 Notch protein expression rate in AL groups and the control group

B-ALL細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá) T-ALL細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)

AML細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá) 對(duì)照組

注：圖中箭頭指向?yàn)殛?yáng)性細(xì)胞，免疫組化SP法，×400。

圖2 Notch1蛋白在AL兒童與對(duì)照組骨髓細(xì)胞中的表達(dá)

Fig. 2 Notch1 protein expression in bone marrow cells of AL children

and the control group

2.2 Notch1蛋白與急性淋巴細(xì)胞白血病臨床危險(xiǎn)度分型的關(guān)系

32例ALL患兒中，Notch1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR依次升高，HR組高于LR組及MR組，但組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 Notch1蛋白在ALL各型的表達(dá)[n(%)]

Table 1 Notch1 protein expressions in each types of ALL [n(%)]

3 討論

3.1 關(guān)于Notch基因

Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，是在進(jìn)化上高度保守的一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，其功能部分缺失會(huì)在果蠅的翅緣造成切跡，Notch基因調(diào)控著從果蠅到人類(lèi)幾乎所有組織、器官細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。人類(lèi)共有4個(gè)Notch受體(Notch1～Notch4)和5種Notch配體(Delta-like1、3、4，Jagged1和Jagged2)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Notch1基因的研究成果頗多[6-8]。相鄰兩個(gè)細(xì)胞Notch1受體與配體結(jié)合后，Notch1信號(hào)通路立即激活，經(jīng)過(guò)3步蛋白水解過(guò)程，從細(xì)胞膜上釋放其胞內(nèi)活性成分ICN1(Notch1)，ICN1最終定位于細(xì)胞核內(nèi)，參與轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體的形成，經(jīng)過(guò)一系列中間過(guò)程最終激活下游靶基因Hes-1等的轉(zhuǎn)錄，對(duì)細(xì)胞分化的起始過(guò)程進(jìn)行簡(jiǎn)單卻精準(zhǔn)的調(diào)控。

3.2 Notch1蛋白在兒童急性白血病中的意義

Notch基因與惡性腫瘤的關(guān)系最早在人類(lèi)T-ALL中被發(fā)現(xiàn)。在T-ALL中，存在Notch信號(hào)的普遍活化，Notch基因的高表達(dá)，T細(xì)胞惡性腫瘤幾乎都有Notch信號(hào)通路的活化[9]。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，ICN1增多和T-ALL的發(fā)生有很大關(guān)系，將ICN1植入小鼠體內(nèi)，能100%誘發(fā)小鼠T-ALL[10]。目前Notch信號(hào)途徑阻斷劑GSI已用于T-ALL的臨床治療，研究指出，在T-ALL的移植模型上進(jìn)行持續(xù)GSI治療以后能產(chǎn)生有效的抗白血病反應(yīng)，而且能獲得較好的耐受[11]。盡管GSI會(huì)造成胃腸道毒性，但其能逆轉(zhuǎn)T-ALL的糖皮質(zhì)激素抵抗，如果將GSI和糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用能夠減輕其胃腸道毒性[12]，這也提示，針對(duì)Notch信號(hào)途徑的治療能為T(mén)-ALL的治療提供新的治療思路。Notch1作為治療腫瘤的新靶點(diǎn)，在現(xiàn)代腫瘤研究領(lǐng)域中具有十分重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)中，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)42例兒童急性白血病進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Notch1在兒童不同類(lèi)型AL中的表達(dá)有明顯差異，T-ALL發(fā)病與異常的Notchl信號(hào)有關(guān)。與正常對(duì)照相比，在AML患兒中，Notch1蛋白陽(yáng)性率增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但ALL差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ALL和AML比較，差異同樣無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，Notch1信號(hào)可能在AL中起著重要作用。前期研究曾經(jīng)應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)32例ALL患兒mRNA表達(dá)陽(yáng)性率進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)Notch1在T-ALL中明顯高表達(dá)，而在B-ALL中表達(dá)水平較低[13]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。

王冠玲等[5]應(yīng)用免疫組化的方法對(duì)11例AML患兒研究發(fā)現(xiàn)，Notch1受體蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高，表明Notch1在粒系來(lái)源的髓性白血病中可能起著重要作用。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)10例AML兒童骨髓細(xì)胞中的Notch1蛋白，得出同樣結(jié)論。然而，事實(shí)是否真如此，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討。

Notch信號(hào)與B淋巴細(xì)胞惡性疾病也關(guān)系密切。霍奇金病的惡性B細(xì)胞中檢測(cè)到Notch1受體的高表達(dá)，Notch1受體活化后與配體相結(jié)合，信號(hào)通路被激活，促進(jìn)B細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化，抑制了亞砷酸引起的細(xì)胞凋亡。也有研究指出，Notch高表達(dá)可以抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，若阻斷Notch信號(hào)后，p53表達(dá)升高并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序以促使腫瘤消退[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在B-ALL患兒中，Notch1蛋白陽(yáng)性率雖有增高，但差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮是否與樣本數(shù)較少有關(guān)。

另外，本研究對(duì)32例ALL患兒Notch1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR水平依次升高，盡管組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是否該檢測(cè)與ALL的臨床危險(xiǎn)度分型存在關(guān)聯(lián)，還需要收集數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。

在兒童急性白血病中，存在著Notch1信號(hào)的活化。其在兒童不同類(lèi)型急性白血病中的表達(dá)有明顯差異，在急性淋巴細(xì)胞白血病T-ALL患兒中的Notch1表達(dá)高于B-ALL；在兒童急性髓細(xì)胞白血病中Notch1也呈異常表達(dá)，Notch1在兒童AML的發(fā)病中可能也起著一定的作用。

[1]桂永浩主編.小兒內(nèi)科學(xué)高級(jí)教程[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2014:328.

[2]Zhu Y M, Zhao W L, Fu J F,etal. Notchl mutations T-cell acute lymphoblastic leukemia:prognostic significance and implication in multifactorial leukemogenesis[J].Clin Cancer Res,2006,12(10):3043-3049．

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組,中華兒科雜志編輯委員會(huì).兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第三次修訂草案)[J].中華兒科雜志,2006,44(5):392-395.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組,中華兒科雜志編輯委員會(huì).兒童急性髓細(xì)胞白血病診療建議[J].中華兒科雜志,2006,44(1):877-878.

[5]王冠玲,胡群,劉雙又,等.急性白血病患兒Notch1蛋白表達(dá)及其臨床意義研究[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志,2010,25(10):783-786.

[6]Kathleen M, Capaccione, Sharon R P. The Notch signaling pathway as a mediator of tumor survival[J].Carcinogenesis,2013,34(7):1420-1430.

[7]Liu W Y, Katherine M. Morgan,etal. Activation of the Notch1 Stem Cell Signaling Pathway during Routine Cell Line Subculture[J].Front Oncol,2014,4:211.

[8]Koyama D, Kikuchi J, Hiraoka N,etal. Proteasome inhibitors exert cytotoxicity and increase chemosensitivity via transcriptional repression of Notch1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2014,28(6):1216-1226.

[9]Chiaramonte R, Cal Zavara E, Balirdi F,etal. Differential regulation of Notch signal transduction in leukaemia and lymphoma cells in culture[J].Cell Biochem,2003,88(3):569-577.

[10]Ma J，Wu M. The indicative effect of Notch1expression for the prognosis of T-cell acute lymphocytic leukemia: a systematic review[J].Molecular Biology Reports,2012,39(5):6095-6100.

[11]Paganin M, Ferrando A. Molecular pathogenesis and targeted therapies for NOTCH1-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Blood Rev,2011,25(2):83-90.

[12]Real P J , Ferrando A A. NOTCH inhibition and glucocorticoid therapy in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2009,23(8):1374-1377.

[13]趙曉莉,潘凱麗,錢(qián)新宏,等.兒童急性白血病Notch1和Jagged1的基因表達(dá)[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2012,14(2):105-109.

[14]Wickremasinghe R G, Prentice A G, Steele A J. p53 and Notch signaling in chronic lymphocytic leukemia: clues to identifying novel therapeutic strategies[J].Leukemia,2011,25(9):1400-1407.

[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：潘凱麗]

Expression of Notch1 protein in children with acute leukemia and its significance

ZHAO Xiao-li1, QIAN Xin-hong2, PAN Kai-li2, LI Ying-xia2, WANG Ying-juan2

(1.DepartmentofPediatrics,FourthPeople’sHospitalofShaanxi,ShaanxiXi’an710043,China;2.DepartmentofPediatrics,XijingHospitalFourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To study the expression of Notch1 protein in children with acute leukemia (AL) and to explore the relationship of Notch1 expression with immunophenotype. Methods The bone marrow smears of 42 cases of AL and 22 healthy children or cases of nonmalignant hematologic disease were collected during October 2009 to November 2011. Immunocytochemical assay was used to detect the expression of Notch1 protein in the cases. Results Of 42 cases of AL, there were 32 cases of acute lymphocytic leukemia (ALL) including 25 cases of B-ALL and 7 cases of T-ALL, and 10 cases of acute myelogenous leukemia (AML). The expression rate of Notch1 protein was 60.0%(6/10), 71.4%(5/7), 28.0%(7/25)and 13.6%(3/22)in AML group, T-ALL group, B-ALL group and the control group, respectively. Compared with the control group, the expression rate of Notch1 protein in AML group and T-ALL group was remarkably increased, and the differences were significant (χ2value was 7.311 and 8.878, respectively, bothP<0.05). The expression rate of Notch1 protein was higher in B-ALL group than in the control group, but the difference was not significant (P>0.05). The difference in the expression of Notch1 protein between T-ALL group and B-ALL group was not significant (χ2=4.400,P<0.05). The expression rate of Notch1 protein positive cells increased gradually in ALL-LR group, ALL-MR group and ALL-HR group, and that was higher in HR group than in LR group and MR group. But the comparison between groups showed no significant difference (P>0.05). Conclusion There are significant differences in the Notch1 protein among children with different types of AL, and abnormal expression of Notch1 is correlated with the occurrence of T-ALL. Notch1 signals might play important role in AL, which needs further researches to confirm.

acute leukemia (AL); Notch1 protein; immunocytochemistry; children

2015-04-26

趙曉莉(1970-)，女，碩士研究生，主要從事兒童血液、消化疾病的診療工作。

潘凱麗，主任醫(yī)師/教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.006

R725.5

A

1673-5293(2015)04-0672-04