脊髓損傷生物標記物的研究進展

王玉明，唐麗，楊德剛，朱致敏

脊髓損傷生物標記物的研究進展

王玉明1，唐麗2，楊德剛1，朱致敏3

[摘要]脊髓損傷后各病理階段均有各種蛋白表達，代表損傷和修復的病理變化。發現并篩選出理想的生物標志物，有助于進一步評估復雜的脊髓損傷生物反應并判斷預后。目前，已有部分研究就神經元特異性烯醇化酶(NSE)、星形膠質原性鈣結合蛋白S-100β作為脊髓損傷的血清學標志物進行了初步探索。但是，其特異性和敏感性仍需進一步明確。未來仍需開發能預測功能結果的理想生物標志物。

[關鍵詞]脊髓損傷；生物標記物；綜述

[本文著錄格式]王玉明，唐麗，楊德剛，等.脊髓損傷生物標記物的研究進展[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(9): 1045-1048.

CITED AS: Wang YM, Tang L, Yang DG, et al. Advance in research of biomarkers of spinal cord injury (review) [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1045-1048.

創傷性脊髓損傷的預后存在諸多不確定性。不完全性脊髓損傷有多種結局，而完全性損傷也有少數可改善并轉變為不完全性脊髓損傷。因此，準確評估脊髓損傷的程度對于指導治療與判斷預后顯得尤為重要。

在目前的評估手段中，生物標記物日益受到重視。探討外傷性脊髓損傷中生物標志物有著重要的臨床和研究意義。理想的生物標志物應能評價神經組織損傷狀況，并較準確地反映急性外傷性脊髓損傷的預后。

脊髓損傷引起多種生化級聯反應，大多都反映在mRNA和蛋白水平的變化中，但仍不清楚基因參與這些過程的具體細節，不能明確哪種蛋白能成為標記物。在脊髓損傷研究中，生物標志物應具備輔助診斷和判斷預后、指導治療、結果評估和藥物開發的特性[1]。

生物標志物用于監測脊髓損傷應滿足以下驗證標準[2]。①必要特性：生物標記物的變化能描述生物過程。與在疾病或恢復進展過程中臨床變化相符合。②生物標記測量有明確目的，應適合盲法或集中評估；具有可重復性，重復測量可靠性高；特異地針對進展的變化；測量應該低信噪比；安全、可耐受，不應要求操縱控制。③成本相對便宜，容易使用。④縱向研究得到數據應該能用于足夠數量的脊髓損傷個體，測量允許評價分布性質信息；允許計算樣本的大小和權重，評估特定治療對脊髓損傷的影響。

1　脊髓損傷后代表病理變化的蛋白表達變化

1.1細胞凋亡

第一階段有半胱天冬酶、c-Jun、p53、Fas、FasL、CD95、Rho蛋白；第二階段有半胱天冬酶、c-Jun、核因子-κB (nucle-ar factor-κB, NF-κB)、熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSP)。

1.2生長和分化

第一階段有波形蛋白、轉化生長因子β(transforming growth factor, TGF-β)、ania-6；第二階段有波形蛋白、TGF、血管生長因子(vascular growth factor, VGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、酪氨酸激酶B (Tyrosinekinase, TrkB)；慢性階段有波形蛋白、TrkB、骨形態發生蛋白。

1.3炎癥反應

第一階段有白細胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、IL-1β、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors, IGF)、細胞因子信號抑制物(suppressor of cytokine signaling, SOCS)、單核細胞趨化蛋白(monocyte Chemoattractant protein-1, MCP-1)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、IL-4R、環氧酶-2(cyclo-oxygen-ase-2, COX-2)、IL-2Rα、HSP；第二階段有IL-6、IL-1、IGF、SOC、MCP-1(IESR-JE)、ICAM-1、iNOS、GFAP、腫瘤壞死因子受體、COX-3(-)、HSP27；慢性階段有IL-6、IL-1β、IGF、HSP2。

1.4離子轉運的調控

第一階段有Ca2+-ATP酶(-)(“-”表示表達下調。下同)；第二階段有Ca2+-ATP酶(-)、K+通道、Na+通道(-)、Na+/K+-ATP酶(-)；慢性階段有Ca2+-ATP酶(-)。

1.5神經保護

第一階段無；第二階段有金屬硫蛋白Ⅰ和Ⅱ、生存的運動神經元；慢性階段有金屬硫蛋白Ⅰ和Ⅱ。

1.6神經元之間的信息交流

第一階段有突觸相關蛋白-25 (synapse-associated proteins-25, SNAP25)(-)、syntaxins(-)、谷氨酸受體；第二階段有SNAP25(-)、syntaxins(-)、突觸蛋白(-)、生長抑素(-)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)轉運體(-)、谷氨酸受體、GABA受體(-)、谷氨酸轉運體；慢性階段有GABA受體。

1.7神經元和神經膠質細胞的修復和再生

第一階段有巢蛋白、兩面神激酶(Janus kinase, JAK)、信號傳導及轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)、c-Fos；第二階段有巢蛋白、波形蛋白、發動蛋白(-)、c-Fos；慢性階段有semaphorin、生長停滯特異性基因-7(growth arrest specific proteins -7, GAS-7)、epithelins 1和2、血小板因子4。

1.8傳遞外部信息到細胞核中的蛋白質

第一階段有磷酸二酯酶(phosphodiestera, PDE)、CaM激酶(-)；第二階段有PDE、有絲分裂活化蛋白(mitogen-activated protein, MAP)激酶、CaM激酶(-)。

1.9產生和維持細胞結構的蛋白質

第一階段無特異蛋白；第二階段有髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)(-)、神經絲蛋白、溶酶體關聯膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP1) (-)、微管相關蛋2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)、tau蛋白(-)。

1.10DNA合成的調節

第一階段有Fra-1、神經生長因子誘導A基因(nerve growth factor induced Agene, NGFI-A)；第二階段有Fra-1、NGFI-A。

蛋白質和DNA基因芯片的研究分析可準確反映脊髓損傷變化[1]。

2　脊髓損傷生物標志物的研究現狀

MRI不能區分組織破壞和水腫的進程，神經電生理監測也很少能應用于急性期脊髓損傷患者[3]。因此，血清測試可能為脊髓損傷后持續的組織破壞提供定量評估，協助臨床決策。

直接從脊髓組織獲得mRNA或蛋白質樣品非常困難，并且可能會引起并發癥。mRNA和蛋白的最實際來源是血清和腦脊液。穿刺獲得腦脊液是侵入性程序。盡管抽取血液樣本容易收集血清，但是由于血液樣本中存在多種蛋白質，如白蛋白、免疫球蛋白G和轉鐵蛋白(占血清總蛋白約80%)，將導致分析復雜化。這些背景蛋白質水平較高，難以篩選出低濃度水平變化的蛋白質，樣本有效性難以保證。來自神經元和神經膠質細胞的mRNA表達不夠豐富，并迅速降解；同時，由于血清和腦脊液是脊髓mRNA和蛋白的間接來源，并沒有很好地體現與脊髓損傷有關聯基因的整體數量。此外，表達的蛋白質通常僅限于那些在細胞表面和細胞內的小濃度mRNA以及細胞死亡時釋放的蛋白質，進一步限制了生物標志物分析[1]。

成像技術、生物標記結合分子遺傳技術，通過界定細胞活動和功能改變的特異性分子，監控損傷和恢復的進程，可為研究人員提供功能強大的工具。快速、操作簡單、低成本、經論證有效、對中樞神經損傷進行確診及定量評估的血液檢測將非常有價值。神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)、星形膠質原性鈣結合蛋白S-100β作為中樞神經損傷的特異標志物，目前在腦損傷疾病的血清測量方面有大量研究[4-11]，借鑒其經驗，脊髓損傷領域已有初步研究，但臨床文獻較少[12-13]。

2.1NSE、S-100β的生物學特性

烯醇化酶有5種異構酶，分別由免疫性質不同的3種亞基α、β、γ組成，即αα、ββ、γγ、αβ、αγ，均為胞漿二聚體酶。烯醇化酶普遍存在于生物體內的糖酵解代謝中，它催化α磷酸甘油轉化為磷酸烯醇式丙酮酸。免疫組化研究表明，烯醇化酶同工酶均存在于細胞漿中，γγ型特異性地存在于神經元和神經內分泌細胞中，故名為NSE，是目前唯一能特異性反映神經元損傷的生化標志物，體內分布部位由高到低依次為腦、脊髓和周圍神經節，腦內NSE水平超過周圍神經節的10～100倍。正常血液中NSE含量極微，約3～8 ng/ml[1]。

當損傷因素影響神經元的代謝、神經元細胞膜功能與結構時，NSE從胞質釋放到細胞間隙和腦脊液中，穿過破損的血-腦屏障進入血液循環，使血清中NSE含量升高。其含量可反映神經元受損的程度，對早期直接而準確地了解中樞神經損傷程度具有重要的臨床意義[13]。

S-100β蛋白是一組可完全溶于中性飽和硫酸銨溶液中的酸性鈣結合蛋白，由α、β兩個亞基組成。中樞神經系統表達的主要是S-100ββ(又稱S-100β)，在人體主要集中于中樞神經系統的星形膠質細胞、少突膠質細胞和周圍神經系統的施萬細胞。其主要生物學功能包括：①調節細胞間交流和細胞內的信號傳遞等過程；②生理濃度的S-100β具有神經營養作用；③促進軸突生長、膠質細胞增生、神經元分化和Ca2+內環境的穩定等。

正常情況下，S-100β血清含量<0.12 μg/L。血清S-100β達0.15～0.5 μg/L為臨界值，>0.5 μg/L為病理性升高。S-100β水平可反映膠質細胞損傷程度。膠質細胞損傷后，星形膠質細胞大量釋放S-100β，刺激星形膠質細胞和小膠質細胞等產生大量致炎性因子和一氧化氮(nitric oxide, NO)，導致神經元功能障礙或死亡[14-17]。

2.2NSE、S-100β與脊髓損傷的關系

脊髓損傷后的病理生理改變和預后是研究關注的重要問題。外傷性脊髓損傷患者常在最初創傷急性期后出現運動和感覺功能障礙。脊髓損傷急性期后的病理過程，包括缺血、細胞內鈣增加、自由基和脂質過氧化生成、興奮性氨基酸產生及炎癥過程，均由不同因素介導。但是，目前外傷性脊髓損傷急性期的神經生理活動細節尚未闡明，反映脊髓神經損傷病理改變進而預測結果的生物標記物尚待研究。

NSE、S-100β在腦損傷及腦疾病領域的相關研究可為其在脊髓損傷中的變化規律及其在神經病理生理中的意義提供借鑒。眾多研究結果提示，S-100β涉及膠質和神經細胞損傷病理機制和重塑機制，是神經細胞完整性的生物標志物，與治療和預后相關。

S-100β在損傷時由于膠質破壞而升高，在嚴重損傷時持續升高，反映了急性期蛋白反應。由于其分子量小，易透過血腦屏障，所以血清濃度能反應腦脊液水平，并且比腦脊液水平更能反映神經的代謝。S-100β還與脊髓損傷后疼痛和痙攣的調制有關，通過測定S-100β濃度可以反映一部分實質變化[18]。

目前對脊髓損傷后蛋白作為生物標記物的變化能否準確反應神經損傷病理變化及指示預后仍在繼續研究中。

研究急性脊髓損傷模型發現，S-100β、NSE蛋白水平顯著升高[19]。Loy使用動物脊髓挫傷模型，發再血清NSE和S-100β蛋白在急性脊髓損傷后6 h增加，隨后24 h內減少。研究表明，早期血清NSE升高與脊髓損傷后數小時內在原發部位發生神經元死亡的一個波峰相關。S-100β蛋白定位在星形膠質細胞，因此可以被認為是脊髓損傷后白質異常的一個主要標記[13]。王華等報道血清NSE與患者脊髓損傷程度成正相關[20]。動態觀察表明，不同時段的血清NSE與脊髓損傷程度的相關性不同。傷后第3天血清NSE與脊髓損傷程度相關性最高，第1天最低，表明傷后第3天測定血清NSE濃度最能反映脊髓損傷程度。將NSE與影像學方法進行比較發現，傷后第2、3天血清NSE水平較影像學方法更能反映脊髓損傷程度[20]。另有報道，血清S-100β水平可以用來判斷預后，但NSE卻不能[21]。血清NSE與脊髓損傷程度具有相關性這一初步結論能否經受大樣本檢驗，頸髓、胸髓、腰髓和神經根損傷NSE表達是否會有區別，這些問題都有待于進一步探討。

NSE和S-100β蛋白可能是評估組織損失和預測急性脊髓損傷功能預后的實驗工具，但仍未明確[14]。NSE、S-100β在脊髓損傷領域的初步研究結果顯示，這兩種蛋白缺乏作為脊髓損傷生物標記物應具有的特異性和敏感性，暫不能可靠地測量急性期脊髓損傷后的二次生理變化機理，也不能預測脊髓損傷患者預后并發展有針對性的治療對策。因此，脊髓損傷后蛋白能否作為生物標記物準確反應神經損傷病理變化及指示預后仍需進一步研究。

創傷性脊髓損傷的生物檢測通常受酒精、藥物中毒、嚴重全身損傷、極早期醫療檢查等多因素影響。在檢測過程中，應該仔細考慮與臨床應用相關的潛在問題，例如，多發傷、溶血、復蘇狀況不佳等情況，盡可能人為地提高這些標志物水平[22]。同時，必須注意控制這些臨床變量確保準確的結果和防止錯誤結論。

理論上，血清標志物在一定程度上有助于評價組織損傷程度、神經功能狀態及急性外傷性脊髓損傷預后。因此，即使存在以上問題，我們也應積極探討外傷性脊髓損傷中血清標志物的試驗及臨床意義。通過研究特定脊髓損傷動物模型及臨床急性脊髓損傷患者中NSE、S-100β隨時間的變化情況，填補實驗數據空白，為未來的相關研究奠定基礎。

軸突特異性蛋白作為繼發性軸索損傷和再生的標記，最有可能通過基因芯片或蛋白質組學方法鑒定[23-27]。這些軸突特異性標志物可能揭示繼發性軸索損傷機制以及再生機制[28]。

3　脊髓損傷生物標志物的前景或展望

到目前為止，脊髓損傷長期預后的最好指標仍然是傷后最初幾天的臨床恢復程度。目前，沒有生物標記物能明顯顯示活體脊髓細胞發生的變化，如軸突生長、細胞死亡或基因表達等。未來研究應該集中在軸突特異性蛋白，并最有可能通過基因芯片或蛋白質組學方法努力發現能準確地在脊髓損傷急性期預測功能結果的生物標志物，作為繼發性軸索損傷和再生的標記。

脊髓損傷領域的研究者應借鑒多發性硬化、阿爾茨海默病、癌癥生物學等其他領域的研究方法。目前重點推進的蛋白質組陣列和臨床生物標志物識別研究，可為脊髓損傷的研究提供幫助。希望在不久的將來，脊髓損傷后生物標志物能用于患者個體的臨床診斷或預測。

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·綜述·

作者單位：1.中國康復研究中心北京博愛醫院脊柱脊髓功能重建科，北京市100068；2.首都醫科大學康復醫學院，北京市100068；3.廣東省廉江市人民醫院，廣東廉江市524400。作者簡介：王玉明(1965-)，男，漢族，內蒙古包頭市人，碩士，副主任醫師，主要研究方向：骨科和脊柱脊髓損傷。

Advance in Research of Biomarkers of Spinal Cord Injury (review)

WANG Yu-ming1, TANG Li2, YANG De-gang1, ZHU Zhi-min3
1. Department of Spinal and Neural Function Reconstruction, Beijing Bo'ai Hospital, China Rehabilitation Research Center, Beijing 100068, China; 2. Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine, Beijing 100068, China; 3. The Lianjiang People's Hospital, Lianjiang, Guangdong 524400, China

Abstract:Various functional proteins are differently expressed in each pathologic stage after spinal cord injury, representing injury and the pathological change of repair. Ideal biomarker is helpful to evaluate complicated biological reactions of spinal cord injury and predict prognosis. As specific serum markers of central nerve injury, neuron-specific enolase (NSE) and astrocyte primary calcium binding protein S-100β had been studied preliminarily, but the specificity and sensitivity need more research. Future efforts still need to develop ideal biomarkers to predict functional outcome.

Key words:spinal cord injury; biomarker; review

(收稿日期：2014-07-25修回日期：2014-09-19)

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(No. 2012CZ-35)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.013

[中圖分類號]R651.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1045-04