PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

趙西耀，何芳梅

PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

趙西耀1，何芳梅2

[摘要]目的探討中國漢族人群中PSMA6基因rs17458312(-1520C/T)位點(diǎn)的多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性。方法對211例腦梗死患者(病例組)和201例健康體檢者(對照組)，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)檢測PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，并分析其基因型及等位基因頻數(shù)的分布。結(jié)果CC、CT、TT基因型頻率及C等位基因頻率在兩組中分布無顯著性差異(P>0.05)。性別分層后，各亞組各基因型及等位基因頻率分布也無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)SMA6基因rs17458312位點(diǎn)可能與腦梗死的發(fā)病無關(guān)。

[關(guān)鍵詞]PSMA6基因；單核苷酸多態(tài)性；腦梗死

[本文著錄格式]趙西耀，何芳梅. PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(9): 1091-1094.

CITED AS: Zhao XY, He FM. Association of rs17458312 polymorphism of PSMA6 gene with cerebral infarction [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1091-1094.

研究顯示，泛素蛋白酶體系(ubiquitin-proteasome system, UPS)參與動(dòng)脈粥樣硬化全過程的調(diào)節(jié)[1]，UPS的基因多態(tài)性可能增加動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥，如腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)。蛋白酶體α6亞單位(proteasome subunit α type 6, PSMA6)是該體系的一個(gè)重要成分，已有許多研究發(fā)現(xiàn)PSMA6基因-8C/G位點(diǎn)(rs1048990)與冠心病、心肌梗死、糖尿病、頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度、腦卒中等相關(guān)[2-5]。對于該基因的其他位點(diǎn)，目前研究很少。本文在中國漢族人群中對該基因的啟動(dòng)子rs17458312位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)查，分析其基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制。

1　對象與方法

1.1對象

病例組為2012年1月～2015年4月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者，病程≤1周，均為漢族，共211例。其中男性120例，女性91例；年齡37～82歲，平均(67.6±7.2)歲。所有患者均經(jīng)臨床及CT和/或MRI確診(依照第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn))，排除心臟源性腦栓塞(房顫、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脫垂、心臟黏液瘤)、腔隙性腦梗死、動(dòng)脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤等其他原因引起的腦梗死。

對照組為同期該院健康體檢者，均為漢族，共201名。其中男性112名，女89名；年齡36～80歲，平均(66.4±9.0)歲；均無腦卒中史，并經(jīng)臨床檢查和/或影像學(xué)檢查排除腦卒中。

兩組間性別、平均年齡均無顯著性差異(P> 0.05)。見表1。

表1　兩組一般資料比較

所有標(biāo)本的收集均經(jīng)本人或其家屬同意，并經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

取清晨空腹靜脈血5 ml，3.8%檸檬酸鈉抗凝，碘化鉀法提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)(DNA序列號NC_000014.9)及其兩側(cè)DNA序列，在NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶，該位點(diǎn)合適的限制性內(nèi)切酶為MspI。

應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行PCR引物序列設(shè)計(jì)，評分≥80分，包含實(shí)驗(yàn)研究的酶切位點(diǎn)并利于酶切結(jié)果分析的引物，并參考通用教材《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》中引物設(shè)計(jì)原則。引物由上海生工公司合成，

上游：5′-TAAATG GGAGTG TGC CTT GG-3′；

下游：5′-CAG GAGATC CAG GTT GCAGT-3′。

PCR反應(yīng)體系共15.0 μl，包括10×Buffer 1.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.3 μl，50 pmol/μl上下游引物各0.2 μl，基因組DNA 0.5 μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1 μl，MgCl 21.2 μl，dH2O 11.0 μl。

PCR反應(yīng)條件：95℃熱變性5 min，95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s。40個(gè)循環(huán)后于72℃延伸6 min，終止反應(yīng)。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10.0 μl、MspI酶0.1 μl、dH2O 3.4 μl及10×Buffer R 1.5 μl，使總體系為15.0 μl。37℃酶切7 h。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，150 V電泳0.5 h，觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。性別比例差異采用χ2檢驗(yàn)，兩組間平均年齡以(xˉ±s)表示，采用t檢驗(yàn)。基因型和等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算、Hardy-Weinburg平衡吻合度檢測，基因型和等位基因組間差異采用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

含有PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物長191 bp，經(jīng)MspI酶消化后產(chǎn)生兩個(gè)片段，分別長132 bp和59 bp。雜合子CT基因型有3個(gè)片段，分別長191 bp、132 bp和59 bp；純合子TT基因型只有1個(gè)片斷，長191 bp；純合子CC基因型有2個(gè)片斷，長132 bp和59 bp。

病例組、對照組PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡(P>0.05)，表明該多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布在所研究的人群中達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。見表2。

CC、CT、TT基因型及C等位基因頻率在兩組中分布均無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

性別分層后，男性及女性基因型及基因頻率在兩組間分布也均無顯著性差異(P>0.05)。見表4、表5。

表2　 Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗(yàn)

表3　兩組基因型及等位基因頻率比較

表4　兩組男性基因型及等位基因頻率比較

表5　兩組女性基因型及等位基因頻率比較

3　討論

UPS是體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的重要因素。許多研究顯示，UPS通過多種途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控。首先，核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)可以調(diào)節(jié)參與動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)，降解炎癥基因的阻滯子IκB蛋白[1,6]。UPS可增加NF-kB活性。其次，增強(qiáng)的氧化應(yīng)激是動(dòng)脈粥樣硬化重要的病理生理事件，UPS通過核因子e2 p45相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 p45 related factor 2, Nrf2)在內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。再次，泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的重要成分，通過促凋亡分子，UPS可以明顯促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成；這些細(xì)胞的退化也需要一個(gè)有功能的UPS。最后，UPS還參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中細(xì)胞死亡的分子調(diào)控[7]。

臨床研究也提示泛素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Herrmann等通過對25例心肌梗死患者進(jìn)行驗(yàn)尸，通過免疫組化和半定量分階段測量等方法，發(fā)現(xiàn)急性心梗患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，泛素水平更高；在冠狀動(dòng)脈新生內(nèi)膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)泛素與平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白共存[1,8-9]。在動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)藥物阻滯泛素蛋白酶通路后，通過激活NF-κB，可以明顯的減弱腦梗死和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[2,10]。

真核細(xì)胞內(nèi)的26S蛋白酶體是UPS的重要成分，其核心是一個(gè)20S的催化顆粒，后者由α環(huán)和β環(huán)組成。人類的PSMA6基因編碼蛋白酶體α環(huán)的α6亞單位。因?yàn)閁PS與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，因此推測PSMA6基因的改變將影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

事實(shí)上，許多研究顯示，PSMA6基因與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、2型糖尿病、心肌梗死相關(guān)[2,11-12]，有理由相信它也與缺血性卒中相關(guān)[13]。

Freilinger等對601例德國缺血性腦卒中患者和736名對照者進(jìn)行研究，對腦卒中患者進(jìn)行TOAST分型，運(yùn)用MALDI-TOF質(zhì)譜法進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因?8C/G位點(diǎn)與缺血性腦卒中整體和大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中均呈相關(guān)性，GG基因型具有保護(hù)作用[14]。Savchuk等對102例烏克蘭缺血性腦卒中患者和92名對照者，運(yùn)用實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行PSMA6基因?8C/G位點(diǎn)的基因型分型，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因?8G/G突變體與復(fù)發(fā)性缺血性卒中相關(guān)[15]。Heckman等對于713例患有腦梗死的白種人和166例非裔美國人進(jìn)行研究，在20個(gè)先前報(bào)道與心肌梗死及冠心病相關(guān)的SNPs中，運(yùn)用多元Logistic回歸分析模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因?8C/G位點(diǎn)與缺血性卒中相關(guān)，在所研究的白種人和非裔美國人中均起保護(hù)性作用[3]。Alsmadi等在1071例沙特阿拉伯冠心病患者和929名健康人中，通過分子信標(biāo)為基礎(chǔ)的基因分型分析的方法，對包括KIAA0391和PSMA6在內(nèi)的染色體區(qū)域14q13.2的5個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)單倍體型1A-2G-3C-4A-5A增加冠心病及心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

對于rs17458312位點(diǎn)，目前未見相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，CC、CT、TT基因型及C等位基因頻率分布在患者及健康人中均無顯著性差異；性別分層后，各亞組各基因型及等位基因頻率也均無顯著性差異。故該位點(diǎn)可能與中國漢族人群腦梗死的發(fā)病無關(guān)。

目前的研究樣本量不夠大，同時(shí)存在抽樣誤差，群體代表性不完全，且可能存在遺傳、種族、環(huán)境因素等作用，該基因型是否與腦梗死發(fā)病相關(guān)，還需通過加大樣本量，包含多中心、不同種族的研究等多種方式，進(jìn)一步明確，以為預(yù)防及治療腦梗死提供分子遺傳機(jī)制。

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作者單位：1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院建德分院神經(jīng)內(nèi)科，浙江建德市311600；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安市710077。作者簡介：趙西耀(1980-)，男，漢族，河南開封市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)疾病的遺傳學(xué)。通訊作者：何芳梅(1982-)，女，漢族，甘肅天水市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)疾病的遺傳學(xué)。E-mail: morning820305@163.com。

Association of rs17458312 Polymorphism of PSMA6 Gene with Cerebral Infarction

ZHAO Xi-yao1, HE Fang-mei2
1. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital (Jiande Branch), School of Medicine, Zhejiang University, Jiande, Zhejiang 311600, China; 2. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Xi'an, Shaanxi 710077, China

Abstract:Objective To evaluate the association between rs17458312 (-1520C/T) polymorphism of PSMA6 gene and cerebral infarction in Chinese Han population. Methods 211 cerebral infarction patients (case group) and 201 healthy controls (control group) were selected in the study. The single nucleotide polymorphism of rs17458312 of PSMA6 gene was identified with the polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). The genotypes and allele frequencies distributed in cerebral infarction patients and healthy controls were analyzed. Results The frequencies of CC, CT, TT genotypes and the C allele all revealed no significant difference between the case group and the control group (P>0.05). After stratified by genders, the difference among all genetypes and alleles weren't significant between subgroup (P>0.05). Conclusion The rs17458312 of PSMA6 gene might not be associated with the cerebral infarction.

Key words:PSMA6 gene; single nucleotide polymorphism; cerebral infarction

(收稿日期：2015-04-10修回日期：2015-07-13)

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010JK803)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.023

[中圖分類號]R743.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1091-04