量子點遺傳毒性研究進展

何克宇，唐萌（教育部環境醫學工程重點實驗室，東南大學公共衛生學院&蘇州納米科技協同創新中心；江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009）

量子點遺傳毒性研究進展

何克宇，唐萌
（教育部環境醫學工程重點實驗室，東南大學公共衛生學院&蘇州納米科技協同創新中心；江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009）

有關量子點（QD）的遺傳毒性作用研究取得了一定進展。研究顯示，QD進入內環境后通過產生活性氧和釋放有毒內核離子這兩種機制產生遺傳毒效應。彗星實驗及微核實驗表明，QD產生的遺傳毒效應主要是DNA損傷和染色體畸變。DNA損傷和染色體畸變的程度受多個影響因素控制：QD濃度越高毒效應越強；QD粒徑越小越易進入細胞核并產生遺傳損傷；表面帶負電荷的QD毒性更強；裸核QD的毒性比外殼包覆的QD毒性強。另外，QD在不改變細胞遺傳物質的條件下，通過表觀遺傳學改變也可產生遺傳效應，使有害效應持續存在。

量子點；DNA損傷；活性氧；納米材料

量子點（quantum dots，QD）因其獨特的光學、電學特性被廣泛應用于各個領域，尤其是生物醫學和生物科技領域［1-2］。在為人們帶來進步和便利的同時，QD的潛在毒性也不可忽視。QD的肺毒性［3-4］、生殖毒性［5-7］和神經毒性［8-9］等毒性已被全球多個實驗室證實，QD越來越廣泛地應用也增加了暴露風險。深入進行QD的毒理學研究工作，闡明QD對健康的影響和機制，并采取相應技術手段（如化學修飾等）降低QD毒性，將QD毒性控制在可接受范圍，才能使QD更為安全地應用于各個領域。本文就QD的遺傳毒性、毒作用機制、毒作用影響因素以及表觀遺傳毒性方面進行了綜述。

1 QD遺傳毒性

遺傳毒性是指外源化學物對遺傳物質產生損害的能力，遺傳毒性實驗是毒理學安全性評價中必不可少的環節，所以在過去的近20年中，國內外學者們通過各種實驗對QD的遺傳毒性已經有了初步的描述和評價。

QD的遺傳毒性表現主要是氧化應激造成的DNA斷裂和染色體畸變，而埃姆斯實驗（基因突變）多呈陰性［10］。染色體數目異常相關研究未見相關報道。

1.1 DNA損傷

單細胞凝膠電泳實驗又稱彗星實驗，是一種快速檢測單細胞DNA損傷的實驗方法。通過彗星實驗已對多種QD的DNA損傷作用進行了驗證。Rocha等［11］使用碲化鎘量子點（CdTe QD）對貽貝染毒3，7和14 d，各染毒組淋巴細胞均發生DNA損傷，且損傷隨時間加重。Katsumiti等［12］使用硫化鎘量子點（CdS QD）對貽貝血細胞染毒，彗星實驗結果顯示導致DNA損傷。李艷博等［13］使用巰基乙酸包覆的CdTe QD 12.50，25.00和50.00 mg·L-1染毒人正常肝HL-7702細胞24 h，均出現顯著性DNA損傷，并且DNA損傷率隨濃度升高也逐漸升高。Munari等［14］觀察到CdS QD 0.01～1.00 mg·L-1染毒RTG-2細胞24 h，各濃度組均有顯著性DNA損傷，并且損傷程度呈濃度-效應相關趨勢，但暴露48 h后，上述濃度組均不出現顯著性DNA損傷，考慮是細胞自身DNA損傷修復的結果。Aye等［15］采用ip給藥方式，用經修飾具有脂/水兩親性的硒化鎘/硫化鋅量子點（CdSe/ZnS QD）對大鼠進行染毒，并取不同組織細胞進行彗星實驗分析，結果顯示，腦、肝和睪丸組織細胞均可觀察到顯著DNA損傷，而在腎和肺組織細胞中未觀察到顯著DNA損傷。說明QD在進入機體后分布具有一定靶向性，可以在特定部位蓄積并產生相應毒效應，同時QD經修飾后能通過生物屏障并對靶組織產生損傷。當然各組織器官受損程度還可能與其特殊的代謝反應和對損傷的修復能力有關，不同組織受損的具體機制仍待探討。除彗星實驗外，QD染毒細胞其他生化實驗結果也支持DNA損傷這一結論。Ju等［16］使用γ-組蛋白2A變異體焦點形成作為判斷DNA斷裂的指標，結果也證明了QD具有DNA損傷作用。

1.2 染色體畸變

染色體畸變是較為嚴重的遺傳損傷。通常用光學顯微鏡在細胞有絲分裂中期即可見，謝廣云等［17］通過鏡下染色體畸變分析觀察到CdTe QD可致經代謝活化的CHL細胞畸變率顯著性升高。在外周血微核實驗中，ip給大鼠CdSe/ZnS QD 0.05 μg·kg-1即可出現外周血網織紅細胞微核率顯著性上升，并且微核率與染毒劑量之間存在正相關關系［15］。CHO細胞是體外微核實驗常用細胞，經CdSe/ZnS QD染毒后，在最低染色體斷裂濃度3.8 μg·L-1，同樣出現了微核率的顯著上升［10］。

另外也有諸多證據表明，QD可通過調節凋亡相關基因和影響凋亡信號轉導通路兩種方式誘導細胞凋亡。QD可通過誘導胱天蛋白酶家族表達、下調p53和Bcl-2基因表達、能使細胞凋亡因子Fas系統和干預線粒體等介導的凋亡信號通路誘發細胞凋亡［18-19］，而細胞凋亡的重要特征就是DNA片段化和染色質固縮。

目前關于QD遺傳毒性研究的觀察終點是類似的，根據損傷程度大小可分為DNA斷裂和染色體斷裂。損傷大小一定程度上取決于染毒劑量和染毒時間，染毒劑量越高損傷程度越嚴重，而染毒時間對損傷程度的影響有別，在一定染毒時間內QD可對DNA產生顯著損傷，若損傷程度控制在一定程度內，由于細胞自我修復機制，損傷可在一定時間內被修復而呈現陰性結果。

2 QD遺傳毒性機制

目前關于QD引起遺傳毒性效應的完整機制尚無定論，但國內外專家的觀點主要集中在活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和QD內核釋放這兩方面原因。

2.1 活性氧生成

蛋白質磷酸化是細胞信號傳遞過程重要環節，ROS可通過影響多種蛋白激酶、磷酸酶發揮細胞調節作用。ROS對激活因子蛋白-1和NF-κB家族也有重要調控作用［20-21］。過量ROS生成可對細胞造成嚴重氧化損傷。研究證實，CdTe QD能生成單線態氧（1O2）［22］。同時QD染毒能引起ROS升高，多個實驗已證實QD染毒可激活細胞DNA修復［23］，引起超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的升高［24］。1O2在QD的作用下在細胞內可進一步產生其他ROS，如羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）。·OH能夠奪取DNA胸腺嘧啶上甲基的氫原子和核糖的氫原子，也能插入到與胸腺嘧啶C5=C6雙鍵，形成各種羥基衍生物，致使DNA損傷［22］。Anas等［22］認為，ROS對DNA堿基的損傷有兩種方式，一是鳥嘌呤與1O2之間發生電子轉移，從而產生鳥嘌呤陽離子自由基最終形成8-羥基鳥嘌呤核苷。另一種方式是·OH直接插入到鳥嘌呤核苷的C8位置形成8-羥基核堿基，隨后重新排列為8-氧鳥苷或2，6-二氮基-5-甲酰-4-羧基鳥嘌呤。

此外，外源抗氧化劑的應用能減少遺傳損傷，也使ROS能部分解釋QD遺傳毒性。Aye等［10］發現，CdSe/ZnS QD 3 mg在黑暗條件下可引起DNA顯著損傷，抗氧化劑麥角硫因使其毒性作用降低50%。Luo等［25］的實驗也證實了抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）對QD染毒細胞DNA的保護作用。

上述實驗證明，QD能產生1O2以及其他ROS，QD對細胞染毒后細胞內ROS升高，持續對DNA產生損傷作用。其機制主要是ROS能與DNA堿基結合形成各種羥基衍生物，破壞DNA結構。細胞內ROS升高會激活細胞自身抗氧化途徑，細胞內超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等升高可作為ROS生成和細胞氧化應激狀態的生物標識，這些抗氧化酶以及抗氧化劑的使用能減少ROS產生的遺傳損傷，促進細胞自身修復。

2.2 QD內核釋放

除了細胞內過量ROS釋放之外，還有一部分研究者認為QD內核釋放也能一定程度上解釋QD遺傳毒性。由于機體內部環境復雜，QD在進入機體后經過一系列的消化、代謝可導致QD外殼被破壞，內部金屬離子釋放，產生或增強遺傳毒性效應。

經研究證實，經光照或酸性環境處理后，QD的毒性顯著上升［10］，與環境因素導致外殼被破壞、QD內核釋放有關。實驗常采用以鎘為內核的QD，鎘能抑制DNA甲基化，也能與位于DNA大溝的鳥嘌呤結合導致堿基損傷［26］，在濃度＞1 μmol·L-1時能抑制DNA合成，而＜1 μmol·L-1時會增強DNA合成和細胞增殖［27］。Cd2+不僅能損傷DNA，還能抑制DNA修復。實驗表明，Cd2+能抑制一些DNA修復蛋白，其中包括錯配系統中的Msh2-Msh6復合物和Msh2-Msh3復合物、核苷酸修復系統的著色干皮病A蛋白以及堿基切除修復系統的甲酰胺基嘧啶糖基化酶、人類8-氧鳥苷DNA糖苷酶、脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶和多聚ADP核糖聚合酶［10］。

研究證實，核殼結構的QD遺傳毒性要遠遠小于裸核QD［27］，使用QD外殼材料甲基聚乙二醇（methyl polyethylene glycol，M-PEG）與M-PEG包裹的CdS QD染毒細胞，實驗結果表明，在相同條件下M-PEG包裹的CdS QD具有遺傳毒性而單獨的M-PEG外殼并無遺傳毒性［14］。

上述實驗說明，QD的遺傳毒性來源于內核，QD毒性與其內核的離子毒性具有相似性，QD內核的釋放會產生或加重QD的遺傳毒性。然而內核釋放也不能完全解釋QD遺傳毒性。有研究發現，在Cd2+濃度相同的條件下，以鎘為內核的核殼結構的QD毒性要高于CdCl2溶液［24］。還有研究結果恰恰相反，常規CdS毒性高于CdS QD［29］，說明QD的遺傳毒性不完全是由其內核毒性的作用。這兩種機制之間不是孤立的，而是相互聯系的。鎘離子能導致細胞內ROS的升高而引起的DNA氧化損傷，細胞內ROS升高能提供一個氧化環境，QD表面氧化會促進內核的離子釋放［30］。有研究顯示，低濃度下細胞毒性的主要機制是ROS過量，而隨濃度升高主要毒作用機制就由ROS過量變為Cd2+釋放，故在一定濃度內鎘QD毒性要高于傳統鎘［31］。另外，也有報道QD能引起細胞內鈣顯著升高［8］，內鈣升高導致鈣依賴性內源性核酸酶激活，也可能是QD遺傳毒性機制之一。

3 影響QD遺傳毒性的因素

3.1 QD濃度

QD的遺傳毒效應在多項實驗中呈現劑量依賴，超過一定閾劑量后才能產生遺傳毒作用，雖然由于實驗對象的差異和實驗條件的不同，閾濃度可能相差較大，但超過閾濃度后通常都可觀測到隨濃度升高產生損傷也越嚴重的趨勢［12-15，32］。濃度依賴的產生可能是由于大量QD產生過量ROS，超過細胞氧化應激代償水平，造成一系列DNA損傷。而使用抗氧化劑NAC后，能升高閾濃度，減少DNA損傷［25］，NAC的保護機制有3個方面［33］：①NAC的巰基使其可黏附在QD表面，使QD穩定，減少ROS產生；②NAC自身就具有抗氧化以及提高谷胱甘肽表達水平的能力；③NAC還能激活抗凋亡信號轉導通路使存活基因表達，對抗應激狀態。

3.2 QD種類與粒徑大小

Munari等［14］使用M-PEG包裹的CdS QD （4 nm）和Ag2S納米粒子（13nm）對RTG-2染毒，彗星實驗結果表明，CdS QD在0.01 mg·L-1濃度下即可產生遺傳毒性，而Ag2S納米粒子在各濃度下均未表現出顯著性DNA損傷。產生這種差異的原因有可能是QD內核不同，也有可能是粒徑的差異，致使兩種納米粒子在細胞內的分布不同以及生物活性差異，使得結局不同。

由于納米粒子特殊的表面效應，使其毒性通常要大于同種常規材料，QD內核粒徑越小生物活性越強，毒性損害也越大。然而，即使同屬納米級別的2種QD，粒徑上的微弱的差異仍會產生毒效應的區別。Ju等［34］就使用了兩種內核尺寸的CdSe QD （QD-440nm、QD-680 nm）進行對照實驗，在對HSF-42細胞染毒2 h后，QD-680 nm的毒作用便趨于穩定，而QD-440 nm DNA損傷則能持續＞24 h，說明內核粒徑越小，QD表現出的生物活性也越強。Lovric等［35］還觀察到兩種尺寸分別2.20 nm和5.30 nm的CdTe QD在細胞內分布的差異，兩種QD的平均直徑，粒徑為5.20 nm的QD對N9細胞染毒后主要分布在細胞質，并未進入細胞核；粒徑為2.20 nm的QD在染毒相同時間后，則主要分布于細胞核。2種QD粒徑均小于細胞核膜通道直徑9 nm，但卻在細胞核中呈現完全不同的分布。其機制可能是在細胞環境中，在生物介質的作用下，多個QD形成共聚體，或者QD與其他細胞蛋白形成復合物，使其實際粒子直徑增大。而2.20 nm的QD形成的聚合物、復合物較小或者更加不穩定，致使兩種粒子通過核膜孔的能力不同。Ipe等［36］的實驗觀測到，在紫外線照射下，CdSe QD只產生·OH而CdS QD既能產生·OH也能產生超氧自由基（O-2·），說明不同內核可能造成代謝產物的種類、數量以及代謝速率的差異，最終導致毒性效應的不同。

3.3 QD外殼及表面修飾

利用包覆材料減小QD毒性是將QD技術安全應用于生物醫學的重要手段。QD外殼對QD遺傳毒性的影響也是十分顯著的，在多個裸核QD與核殼結構QD的對照實驗中已經證實，無毒的包覆材料能減少甚至消除QD的遺傳毒性［28，37］。

QD外殼的差異主要表現在外殼的材料、厚度、表面電荷以及功能基團的差異［36］。Galeone等［1］使用巰基烷酸、聚馬來酐十八碳烯、聚馬來酐十八碳烯-PEG包被CdSe/ZnS QD染毒果蠅血細胞，結果表明，3種QD的生物蓄積量不同，巰基烷酸＞聚馬來酐十八碳烯＞聚馬來酐十八碳烯-PEG，對DNA產生的損傷程度也不同，其嚴重程度與蓄積量呈正相關。Pathakoti等［38］也對多種外殼材料對QD遺傳毒性的影響進行了實驗，結果顯示聚醚酰亞胺包覆和胺修飾的CdSe/ZnS QD遺傳毒性較明顯，而PEG包覆的各類QD幾乎沒有遺傳毒性。這可能是由于聚醚酰亞胺包覆的QD不僅能進入細胞膜，還能引發“質子海綿效應”，即聚醚酰亞胺大量捕獲質子，并引起Cl-內流，導致溶酶體滲透性腫脹、破裂，顆粒釋放，進入細胞質，進一步導致線粒體損傷和細胞凋亡［39］；另外，其毒性也可能來自于表面帶正電的胺基基團。Hoshino等［40］使用各類化學基團修飾QD，表面電荷負電位最高的QD-COOH遺傳毒性最為顯著。

上述研究結果表明，QD的濃度、粒徑、內核材料、外殼材料、表面修飾等都能影響QD遺傳毒性。不同QD產生毒性差異的原因首先是內核本身毒性大小不同，相同條件下，內核毒性高QD整體毒性也高，QD毒性與常規離子的毒性有一定的相似性。外殼材料的特點影響著有毒內核釋放的概率，如果環境中QD外殼破裂相關率大，細胞內內核離子濃度也會相對較高，另外，有些外殼材料或經修飾的外殼材料本身就具有毒性，能促進細胞ROS生成或協助QD穿透生物膜結構，提高毒性。由于QD的表面效應，QD尺寸影響著QD的反應活性，理論上粒徑越小的QD其反應活性越強，毒性也就越強。另外，QD的大小還決定著QD穿過各生物膜的能力，繼而影響QD在細胞中的分布，造成不同尺寸QD直接攻擊的靶位不同。

4 QD表觀遺傳毒性

研究發現，QD不僅能造成遺傳物質損傷，還可能改變基因尤其是與凋亡相關基因的表達水平［41］。Ambrosone［42］觀察到了CdTe染毒引起的凋亡相關基因myc1、胱天蛋白酶3、bcl-2表達水平改變，也檢測到應激相關蛋白，如叉頭框蛋白O類和熱休克蛋白70水平的改變。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）基因家族轉錄翻譯的MT蛋白能調控真核生物細胞及組織內鋅的水平和分布。另外，MT還有保護細胞，防止有毒金屬和氧化應激損傷的功能。Chen等［43］使用不同濃度碲化鎘QD（37.70和300.00 nmol·L-1）染毒HEK293細胞，染毒組細胞MT家族基因（MT-1A，MT-1B，MT-1E，MT-1F，MT-1G，MT-1H）表達均顯著上調。

目前，關于QD引起基因表達水平改變的機制認為，組蛋白是真核生物細胞核內與DNA結合的堿性蛋白，組蛋白在表觀遺傳調控中的作用，如基因表達調節、DNA損傷修復、染色質狀態調控、細胞分化［44］等越來越受到重視。未經修飾的QD表面帶負電，能在人類細胞核內、核仁上快速蓄積，并優先結合帶正電的內核組蛋白形成QD/蛋白質加合物［45］。加合物的形成可能會影響組蛋白的調控作用，從而激活、抑制基因或改變基因表達水平。

內核釋放可能是QD表觀遺傳毒性作用機制之一。其中最常見、研究最多的內核就是鎘離子（Cd2+），Cd2+能抑制DNA甲基化、干擾E鈣蛋白介導的細胞黏附作用［26］，同時又能模擬金屬應答元件結合轉錄因子的Zn2+，從而影響細胞周期、增殖和分化，干擾DNA表達、復制和修復。對于含有Cd2+QD抑制雌激素水平同時又表現出雌激素樣作用的現象［5，46］，研究者們提出了一些猜想：雌激素核受體的C區是與DNA結合的重要結構域，Cd2+能與C區結合，影響雌激素受體對相應DNA序列轉錄調控的作用［7］。另外，某些毒物能模擬內源性配體作用繼而調節其下游基因的表達，所以也可能是Cd2+取代C區鋅指中的Zn2+，使其直接與雌激素反應元件結合有關［6］。

QD通過干擾基因轉錄、翻譯過程使基因非正常表達，產生與直接改變遺傳物質類似的結局，這些不良結局可被修復也可能產生遺傳效應，屬于表觀遺傳毒理學的研究范疇。QD表觀遺傳毒作用機制與遺傳毒性機制有的相似，如兩種主要遺傳毒性機制ROS生成和內核粒子釋放也能引起表觀遺傳改變，造成細胞內mRNA和蛋白質數量、種類異常。當然，QD表觀遺傳毒性機制也有其特殊性，如QD還可通過與組蛋白結合，干擾組蛋白轉錄調控功能。

5 展望

QD遺傳毒性特點、機制尚未形成定論。對于遺傳損傷的檢測仍是較高劑量下會出現較為嚴重的DNA斷裂、染色體畸變甚至細胞凋亡，今后應更加關注更小劑量下堿基、基因序列及組蛋白等生物學改變。目前關于QD毒性機制的猜測主要集中與ROS過量和內核粒子釋放兩方面，但都不能完美解釋迄今為止觀察到的遺傳損傷現象，兩種猜想其實又是相互關聯的，氧化環境能促使內核釋放，內核釋放又能增加ROS釋放，所以兩種機制共同研究，尋找兩者之間的聯系，共同解釋QD遺傳毒性是今后研究探索的方向。QD遺傳毒性影響因素眾多，粒子物質理化特性、環境因素、機體因素以及聯合作用的差異比較都值得進一步研究。同時QD內核、包覆材料、表面修飾、尺寸及劑量等對于控制QD毒性十分重要，是QD技術能否安全應用的關鍵所在。

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（本文編輯：喬虹）

Research advances in genotoxicity of quantum dots

HE Ke-yu，TANG Meng
（Ministry of Education Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering，Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices，Collaborative Innovation Center of Suzhou Nano Science and Technology，School of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China）

The genotoxicity of quantum dots（QDs）has been confirmed by a variety of experiments.When QDs are absorbed in an internal environment，genotoxic effects can be induced in two ways.One is through the generation of reactive oxygen species，and the other is via core release.The comet assay and micronucleus test show that the genetic toxicity effects of QDs are DNA damage and chromosome aberrations.The level of QDs′genotoxicity can be affected by many factors.It has been observed that more severe genotoxicnity can be caused by QDs of smaller size or in higher concentrations. Negative charges modified QDs often show more significant genetic damage.However shelled QDs can be less harmful or even harmless.Besides，the epigenetic toxicity of QDs can make the adverse effect persistent，even to the next generation，without any genetic damage.

quantum dots；DNA damage；reactive oxygen species；nanomaterials

The project supported by National Natural Science Foundation of China（30972504）；National Natural Science Foundation of China（81172697）；National Natural Science Foundation of China（81302461）；National Natural Science Foundation of China（81473003）；NationalImportantProjectonScientific Research of China （2011CB933404）；and Natural Science Foundation of Jiangsu Province（BK2011606）

TANG Meng，E-mail：tm@seu.edu.cn，Tel：（025）83272564

R394

A

1000-3002-（2015）06-01014-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.021

國家自然科學基金（30972504）；國家自然科學基金（81172697）；國家自然科學基金（81302461）；國家自然科學基金（81473003）；國家重大科學研究計劃項目（2011CB933404）；江蘇省基礎研究計劃（自然科學基金BK2011606）

何克宇，男，博士研究生，主要從事納米毒理學研究，E-mail：hekeyu@seu.edu.cn；唐 萌，男，博士，教授，博士生導師，主要從事納米毒理學研究。

唐萌，E-mail:tm@seu.edu.cn，Tel：（025）83272564

（2015-03-02接受日期：2015-06-01）