一種高效轉染西藏小型豬胚胎成纖維細胞的方法

劉 薇，陳 燕，岳 敏，袁 進，邱添武，肖 東，顧為望

(南方醫科大學比較醫學研究所實驗動物中心，廣州 510515)

小型豬因其體型大小、解剖結構、代謝特點、生理生化等方面與人有較大的相似性，近年來越來越廣泛地被用于生物醫學研究，而各種轉基因豬更大大擴展了小型豬在生物醫學研究中的應用范圍。西藏小型豬是本單位2004年由西藏自治區引種至廣州培育而成的實驗小型豬品種，近年來，應用其建立了數種轉基因動物模型［1－2］。

制備轉基因克隆豬常用的豬胚胎成纖維細胞(porcine embryonic fibroblasts，PEFs)是取自豬35日齡胚胎的原代成纖維細胞，將外源基因導入PEFs是制備轉基因克隆豬的第一步［3］。目前常用的將外源基因導入PEFs的方法有脂質體轉染法與慢病毒介導的方法。但是脂質體法轉染PEFs的轉染效率很低，通過較長時間的藥物篩選才能獲得少量的穩定表達轉基因的細胞用于后期的核移植;而慢病毒法能解決轉染效率低的問題，但是慢病毒生產存在一定的技術難度且操作較直接的質粒轉染要復雜，而且對于片段較大的質粒，慢病毒感染的效率會下降。

Nucleofection核轉染技術是一種可以針對不同細胞類型，選擇最佳的轉染程序與轉染試劑的電轉染技術，利用這種方法可以高效轉染難轉染的細胞系和原代細胞(如神經元、免疫細胞、干細胞等)［4］，且轉染效率較高，因其操作便利性與較高的轉染效率，目前已經有一些實驗室將此技術應用到轉基因克隆豬制備的上游工作(將目的基因轉入PEFs)。本實驗室參照已報道的實驗條件，將此技術用于轉染西藏小型豬PEFs，并比較其與傳統脂質體轉染方法在轉染效率上的差別。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 核轉染用試劑與儀器

核轉染試劑:HumanDermalFibroblasts Nucleofector Kit(VPD-1001)(包含pmaxGFP質粒)(德國Lonza公司);Nucleofector II核轉染儀(德國Lonza公司)。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清、高糖DMEM、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺購自 Hyclone公司、LipofectamineTM2000、Opti-MEM、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶和DMSO等購自Invitrogen公司，培養瓶及培養板等購自Corning公司。其余試劑為國產或進口化學純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 借助Nucleofector核轉染儀將pmaxGFP質粒轉染入PEFs

實驗采用本實驗室凍存的西藏小型豬PEFs，將冷凍保存的細胞復蘇后傳代2次，胰酶消化收集細胞，并計數，用VPI-1001試劑盒中的核轉染液重懸細胞(Basic Nucleofector Solution+Supplement 4.5:1)，按106細胞加5 μg的量加入pmaxGFP質粒，將混合液加入電轉杯，使用U020程序進行電轉染，完成電轉染后，盡快用吸管向電轉杯中加入500 μL預熱的培養基，用吸管將細胞混合液轉移到含足量預熱培養液的培養瓶中，放入 CO2培養箱培養一段時間后，觀察細胞的綠色熒光蛋白(GFP)表達情況。

1.2.2 借助脂質體將pmaxGFP質粒轉染入PEFs

同期培養的PEFs，按照Invitrogen推薦的實驗方法，按每六孔板一個孔加 2.1 μg質粒，5.4 μL脂質體的量進行轉染。

2 結果

核轉染5 h后，倒置熒光顯微鏡下可見GFP表達，轉染效率在80%以上，轉染3 d后可見綠色熒光強度明顯升高，轉染效率也保持在80%以上(彩插11圖1)，細胞生長迅速，活力良好。經過傳代培養，發現轉染6 d后，GFP陽性的細胞明顯減少(50%以下)，伴隨熒光亮度減弱。轉染11 d與21 d后，GFP陽性的細胞進一步減少，但直到第21天，可以看到P5代細胞仍有少量細胞表達綠色熒光(彩插11圖1)。說明通過核轉染可以獲得少量穩定整合外源基因的細胞;而用脂質體轉染的PEFs，在12 h才可看到GFP表達，且轉染效率很低(彩插11圖2)，在傳代培養至第7天時，已經不可見綠色熒光。使用本實驗中的核轉染方法轉染PEFs，所獲得的轉染效率明顯高于脂質體法。

3 討論

脂質體法只能介導外源基因的瞬時表達，僅有非常少量的細胞穩定整合了外源基因，需要通過新霉素(NEO)、潮霉素(HYG)等抗性基因來篩選穩定整合的細胞，而對于PEFs這種原代細胞來說，本身脂質體轉染的效率就很低(10%以下)，再加上長達一周的抗生素篩選，使細胞活力大大下降，用這種方法篩選穩定整合目的基因的細胞株耗時很長，且獲得轉基因細胞的成功率低。

Lonza公司研發的核轉染技術是一種非病毒介導的新型轉染技術，該技術在傳統電穿孔技術的基礎上進行改良，設計出包含針對不同類型細胞的優化轉染程序和細胞特異性核轉染試劑。核轉染法就是采用對特定類型細胞配套的核轉染試劑和轉染程序，直接把外源基因導入細胞核中，以達到最佳轉染效率。與脂質體法相比，Nucleofection核轉染的方法可以將質粒DNA直接轉入細胞核內，從而大大增加了質粒DNA整合到宿主基因組的幾率，因此能大大提高穩定整合的效率。

Nucleofector核轉染儀需要針對不同細胞制定最佳的轉染試劑和轉染程序，從生產廠家Lonza的網站上可以查到不斷更新的用戶更新的數據，包含近1000種細胞的轉染試劑、轉染程序、優化實驗方法、轉染效率、細胞活性等信息。但是對于PEFs我們在其網站沒有查到相關信息。而國內崔茂盛［5］、李松［6］等分別對羊和牛的胚胎成纖維細胞進行了核轉染，他們通過篩選多種轉染程序發現針對羊胚胎成纖維細胞的最佳轉染程序是T016，獲得的轉染效率為86%;針對牛胚胎成纖維細胞的最佳轉染程序是V013，獲得的轉染效率為96%。國外Maurisse等［7］發現，針對 PEFs的最優轉染程序為 U020(豬種未提及)，獲得的轉染效率是90%，他們使用的轉染試劑是Human Dermal Fibroblasts Nucleofector Kit(VPD-1001)。Nakayama 等［8］轉染 Clawn 小型豬PEFs時對推薦的10個轉染程序進行篩選得出最優程序U023，獲得了79%的轉染效率，使用的轉染試劑是Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(VPI-1002)。本實驗我們采用 Maurisse的經驗，使用VPD-1001轉染試劑和U020程序，參考成纖維細胞的推薦實驗方法對西藏小型豬PEFs進行核轉染。

利用Nucleofection核轉染技術轉染西藏小型豬PEFs后，目的基因GFP能在PEFs中表達，獲得了較高的轉染效率，轉染效率明顯高于脂質體法轉染PEFs，且傳代21 d后，仍有部分細胞表達GFP，說明通過Nucleofection核轉染能獲得一定比例的穩定整合外源基因的細胞，預示可以通過此方法，再進行抗性篩選，獲得穩定整合目的基因的細胞株，進而為制備轉基因克隆豬提供核供體。

Nucleofection核轉染技術操作簡單，轉染時無需更換無血清培養基，細胞在進行轉染5 h后即可看到熒光表達;而脂質體轉染法，轉染時需要更換無血清培養基，轉染后4～8 h需要換液，以去除其對細胞的毒性，且一般于12 h后才能看到熒光表達，可見，用核轉染的方法，能大大減少實驗操作，縮短實驗周期，適合高通量的細胞轉染實驗。

綜上所述，Nucleofection核轉染的方法具有很多脂質體法不可比擬的優點，是一種高效轉染豬PEFs的方法，值得推廣應用。

［1］ Deng W，Yang D，Zhao B，et al．Use of the 2A peptide for generation of multi-transgenic pigs through a single round of nuclear transfer［J］．PLoS One，2011，6(5):e19986．

［2］ Yang D，Wang CE，Zhao B，et al．Expression of Huntington’s disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs［J］．Hum Mol Genet，2010，19(20):3983－3994．

［3］ 劉薇，賈俊雙，唐華，等．慢病毒載體法制備遺傳工程猴和小型豬的現狀及應用前景展望［J］．中國實驗動物學報，2012，05:84－89．

［4］ Martinet W，Schrijvers D，Kockx M．Nucleofection as an efficient nonviral transfection method for human monocyti c cells［J］．Bi otechrol Lett，2003，25(13):1025 － 1029．

［5］ 崔茂盛，馮沖，張金龍，等．不同體細胞類型和基因轉染方式對綿羊克隆胚胎體外發育的影響［J］．畜牧與獸醫，2012，44(1):57－60．

［6］ 李松，丁方榮，戴蘊平，等．不同轉染方法轉染牛體細胞效率的比較［J］．農業生物技術學報，2011，19(6):1027－1033．

［7］ Maurisse R．，De Semir D．，Emamekhoo H．，et al．Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages［J］．BMC Biotechnology，2010，10(1):9．

［8］ Nakayama A．，Sato M．，Shinohara M．，Matsubara S．，et al．Efficienttransfection of primarily cultured porcine embryonicfibroblasts using the amaxa nucleofection system TM［J］．Cloning and Stem Cells，2007，9(4):523 －534．