微小胞外囊泡對固有免疫系統的調節①

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.031

微小胞外囊泡對固有免疫系統的調節①

沈朝斌蔡紅郁蘭綜述

(上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院，上海200082)

中圖分類號R392.2

文獻標志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1578-07

①本文受上海市中醫藥發展辦公室中西醫結合重點病種(zxbz2012-003)資助。

作者簡介：沈朝斌(1961年-),男,主任醫師,教授,碩士生導師,主要從事中西醫結合免疫調節研究,E-mail:sbsys1303@aliyun.com。

機體為應對外來病原體進行防御和有效的應答，不同的免疫細胞必須進行互相間的交流。細胞間的交流分3類。(1)直接接觸，通過膜上的受體和配體；(2)通過自分泌、旁分泌和內分泌等釋放可溶性分子，作用于靶細胞受體。(3)通過EV釋放信號分子[1,2]。隨著EV組成和功能的深入研究，揭示了第3類廣泛的細胞間交流方式。目前已有成熟的EV研究方法，可以了解其作為轉運載體在細胞間的信息交換，EV包含了不同的生物學活性分子，包括蛋白、脂質和核酸(主要是小RNA)[2]。通過囊泡的細胞間交流能調節生理和病理過程[3]。EV在免疫細胞的作用值得重視，已有許多體內外研究結果提供了充分的證據[4]。

1EV在細胞間交流的作用

EV是指所有來源于細胞分泌的存在于細胞外的囊泡。大量細胞均釋放EV，包括在體外培養細胞的培養液表面和多種體液中(如：血液、尿液和母乳等)[5-7]，同樣的EV可來自不同的細胞亞型。EV能形成向內芽生方式的有膜包被的內體小泡，稱之為多囊泡體(Multivesicular bodies，MVBs)，然后帶著細胞膜釋放到細胞外，這些EV被稱作外泌體(Exosome)，直徑在50~100 nm。同時，EV也能直接從細胞膜通過朝外芽生的方法形成。這些囊泡直徑可大至1 μm，經常被稱之為微囊(Microvesicu-lar)。按目前現有技術，尚無可能從微囊中分離出外泌體。在細胞培養上清液和體液中找到的EV在大小、形狀和分子含量經常因來源不同而各異。EV組成依賴于供體細胞的種類、分化和活化狀況，與微囊的產生過程有關[8]。EV被脂質雙層結構包裹著，以保護囊內信息分子不被細胞外環境所降解。EV膜上具有生物活性的脂質和蛋白質，保護這些囊泡送達靶細胞，并將EV信號傳導到靶細胞。EV的蛋白質種類與不同細胞來源有關。EV蛋白包括：跨膜四蛋白家族、轉膜蛋白和骨架構件[9]。另外，EV也包含了不同細胞產生的特殊蛋白，如APC分泌的MHCⅡ分子[10]。EV相關的核酸主要是小RNA。近年來也有研究發現，骨骼肌細胞EV攜帶了線粒體DNA(mitochondrial DAN,mtDNA)[11]，最新研究還發現胰腺癌細胞株和患者血清來源的EV含有>10 kb雙鏈DNA片段[12]。EV作為多信號成分傳遞裝置能根據受體細胞功能調節和釋放信息。體液中的EV表達可作為檢測疾病的一個潛在臨床生物學指標，不同疾病狀態下EV表達的種類和含量均不同。來自于樹突狀細胞的囊泡已被應用于腫瘤疫苗臨床試驗中[13]。

2EV在免疫系統的介導作用

EV在先天性免疫和獲得性免疫應答之間起著一種調節作用[1,4,8]。EV在免疫系統中的不同作用與它們所包含的生物活性相關分子有關。免疫細胞來源的EV具有免疫刺激或免疫下調作用[4,8]。EV的免疫活化功能包括抗原提呈(通過APC細胞來源的EV)和前炎癥細胞因子的釋放(通過不同免疫細胞來源的EV)。另一方面，來自于DC耐受和誘導性T細胞凋亡的EV能誘導免疫抑制。免疫系統中EV介導功能大多在體外實驗被證明，然而在不同生理和病理狀況下的EV體內功能仍然不清楚。在系統性炎癥疾病中，不同來源的EV可能具有不同的病理作用[14,15]。

EV釋放并被受體細胞攝入，從而在細胞間進行信息交流。在這過程中它的有效性和特異性仍具有不確定性。一次EV釋放，通過一種旁分泌方式傳遞給鄰近的細胞，或者類似于特異性細胞免疫突觸的方式對細胞進行作用。免疫突觸是指在細胞間互相作用接觸區域形成具有高度組織性的超分子結構，如：T細胞與APC細胞的相互作用以及NK細胞和靶細胞的互相作用方式[16]。T細胞來源的囊泡能通過免疫突觸轉移給APC細胞，表明這些突觸也可以轉運EV[17,18]。其他先前的研究結果也表明EV的轉運存在雙相模式，即可檢測到DC釋放的EV存在于T細胞的表面[19,20]。研究觀察到的通過突觸轉運的EV是細胞培養上清液中的EV，是細胞間互相作用接觸區域形成并釋放的部分。

除了短途轉運的EV，它也能通過體液遠距離起作用。相對于局部釋放的EV，通過體液循環到達靶組織器官，具有特異的靶向作用。對于全身播散性的微囊，靶向特異性可能更依賴受體細胞的選擇性應答，這意味著僅僅是針對限定的細胞亞群或組織種類才可能獲得或對微囊中包裹的信息產生應答。靶細胞是通過EV表面的四跨膜蛋白和整合素與之結合[21-23]。EV與淋巴細胞和組織中所包含的多種分子具有靶向作用。在淋巴結中，DC來源的EV與LFA-1和ICAM-1的結合對T細胞以及CD8+細胞的活化十分重要[21]。在淋巴結髓質和被膜竇以及脾臟邊緣區的巨噬細胞上的唾涎酸黏附素(CD169)均能與B細胞來源EV表面的2,3-唾涎酸結合，表明這些EV可以調控淋巴組織[26]。另外，DC來源的EV攜帶了補體C3片段或乳凝集素(MFG-E8)[25,26]，在淋巴器官邊緣區的B細胞和濾泡狀DC上有CD21補體受體的表達，可能有助于有效地捕獲這些具有調理作用的EV[26,27]。綜上所述，EV選擇性靶向與細胞結合依賴于特異的分子間相互作用。

3EV RNA和DNA的來源及調節固有免疫的作用

3.1EV富含非編碼RNA近年來，許多研究表明不同細胞釋放的EV均含有RNA。EV相關的RNA主要由小RNA組成(<200 bp)，但也被檢測到選擇性mRNA和長鏈非編碼RNA(long-non-coding RNAs，lncRNAs)的存在[28]。2007年Valadi等[29]首次報道了EV相關RNA轉運給靶細胞，他們的研究表明小鼠mRNA能通過EV轉移給人類的受體細胞。通過EV水平傳播遺傳編碼信息是目前新確定的細胞間信號傳導方式。

許多研究著重于EV中的microRNA(miRNA)。將EV和它們供體細胞的miRNA譜進行比對，發現有些miRNA是通過EV優先釋放的，與此相反，其他的miRNA(如：miR-218)是保留在細胞中的[30-32]。EV相關的miRNA經常包含了供體細胞特殊的miRNA。例如：有些細胞miR-451和miR-150是優先從EV中排出，這些細胞包括：上皮細胞、腫瘤細胞和間充質干細胞等。miR-142-3p是上皮細胞優先排出的，而不是通過免疫細胞(如：DC、T和B淋巴細胞)排出的[31]。這些微囊和細胞的miRNA譜的差異表明，EV有些RNA分子是被選擇性組裝進入EV的。多項研究指出RNA被選擇性組裝的機制。miRNA摻入的選擇性并不是互補mRNA序列共分離(co-segregation)的結果，而是使用微囊中的miRNA抑制mRNA轉錄機制來解釋的[33,34]。RNA誘導的靜默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)參與了miRNA前體形成過程，并有利于miRNA介導靶mRNA的降解。從外泌體中出現的生理性聚集的MVBs檢測到多種蛋白復合物，說明miRNA整合進入EV可能包含了RISC[33,35]。目前有更直接的證據表明，RNA和RNA結合蛋白是選擇性地進入EV的。T細胞釋放的EV miRNA短的共同基序，這些基序與不均一的核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，hnRNPA2B1)結合，并將特殊的miRNA載入EV[36]。

除了mRNA和miRNA，EV還含有其他RNA種類。近來對免疫細胞來源的EV采用深度測序表明，EV還存在特征性的小RNA(<70 bp)。這些囊泡中含有大量不同的小的非編碼RNA(small non-code RNA,sncRNA)種類。除了少量相關的miRNA，可檢測到對蛋白質編碼區域注釋部分的廣泛轉錄或裂解產物，也可檢測到重復序列或結構RNA[核蛋白復合物行使基本細胞功能的RNA，如：信號識別顆粒(Signal recognition particle,SRP)RNA和穹窿RNA(Vault RNA)][37]，許多小RNA類似于tRNA和mRNA降解的片段[38]，被認為具有基因調節功能[39,40]。在神經細胞、尿液和血漿中的EV也被檢測到小的tRNA和小的Vault RNA[41,42]。

另外，EV中也被檢測到存在lncRNA。雖然大部分lncRNA的功能尚不明確，但有些lncRNA已被明確具有很強的轉錄、轉運和表觀遺傳修飾等調節作用[43]。近期研究資料顯示，在細胞內低表達的特殊的lncRNA在EV中有較高的含量[44]。EV中lncRNA的證據主要來自于小細胞肝癌的研究[45,46]。小細胞肝癌來源的EV含特殊的lncRNA，它來源于TGF-β介導的對化療耐藥的肝癌，這些EV含有的lncRNA促進了腫瘤生長[46]。因此，小RNA和lncRNA代表了這類調節性RNA，它們對基因的調節作用甚至已超過了miRNA的活性。

多個研究表明，EV介導免疫細胞釋放的miRNA均有下調受體細胞靶基因表達的作用[17,47,48]。在這些研究中，EV過度表達的miRNA可抑制靶mRNA，經熒光素酶(Luciferase)標記發現，miRNA轉染受體細胞的部位在3′UTR。目前尚無很好的方法去明確在體內EV轉運RNA的作用。今后的研究方法必須是既能干擾阻止細胞釋放EV，而又不影響其他微囊泡介導作用。這需要增加對靶細胞的囊泡分泌、裝載和釋放其中封閉的信號分子機制的了解。

3.2在固有免疫系統中的EV大量的研究集中于細胞釋放的EV在獲得性免疫中的作用[4,8]。而對EV在調節固有免疫方面的研究才剛剛起步[8,49]。固有免疫也被非免疫細胞釋放的以及體液中不明來源的EV所影響。巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞和NK細胞是已知的釋放EV的先天性免疫細胞，釋放的EV具有調節免疫應答作用。肥大細胞在分泌的顆粒中釋放EV，也同時釋放炎癥介質和蛋白酶[50]。這些EV含有MHCⅡ類分子和特殊的熱休克蛋白，它們具有抗原提呈、DC成熟和誘導Th1應答的作用。細菌感染的巨噬細胞釋放的EV具有免疫活化作用[51]，它能活化鄰近的巨噬細胞和誘導DC的成熟。與此相反，中性粒細胞釋放的EV通過抑制巨噬細胞和非成熟的DC產生前炎癥因子來下調非特異性炎癥[52]。

3.3EV的miRNA對固有免疫應答的調節影響最初的研究結果表明，肥大細胞釋放的EV所含miRNA和mRNA轉運到靶細胞是EV-RNA的介導作用[29]。該研究是通過將肥大細胞暴露在氧化應激條件下產生EV而明確此作用的[53]。這些EV能將氧化應激的耐受性轉運給受體細胞，紫外光對RNA降解可抑制這個作用。多個研究證明，單核/巨噬細胞釋放的EV所含miRNA可將功能轉運給不同類型的靶細胞。這些miRNA功能轉運依賴于產生EV的細胞活化狀況和受體細胞的類型。來自單核THP-1細胞株的EV的 miR-150可以將血管增生調節作用功能性轉運給人微血管上皮細胞HMEC-1株[54,55]。miRNA對供體細胞和受體細胞均有干擾作用，EV介導的miR-150有促進受體細胞形成管腔作用。多個研究報道了巨噬細胞釋放EV中的miR-223具有調節髓樣細胞增殖/分化和腫瘤進展功能[56-58]。Ismail等[48]研究表明，巨噬細胞來源的EV誘導了靶向單核細胞的分化。該研究證明了，巨噬細胞來源的EV釋放的內源性miR-223對miR-223陰性的并轉染了miRNA報告基因載體的靶細胞是有功能性作用的。另外，使用經miR-223拮抗劑處理的單核細胞可以降低它們的分化。雖然原因不明，但研究資料強烈提示EV誘導單核細胞分化作用是由miR-223轉運引起的。巨噬細胞來源的EV富含miR-223也被Aucher等[59]研究所證實。EV的miR-223能有效轉運到肝癌細胞。使用miR拮抗劑和吸附劑去除miR-223，具有抗肝癌細胞增殖的作用。相反，肝癌細胞釋放的EV對先天免疫應答具有調節作用，這些EV含let-7b(miRNA的一種)，并轉運給巨噬細胞，導致前炎癥因子IL-6釋放減少[60]。

3.4EV相關的miRNA對TLR活化的作用近期研究資料顯示，EV包含的miRNA除了具有調節基因的作用外，腫瘤細胞釋放EV所含有的特殊miRNA能作為Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)的配體起作用[61]。腫瘤來源的miR-21和miR-29a能與人的TLR8以及鼠的TLR7結合，并活化在免疫細胞上的這些受體，導致腫瘤轉移前炎癥因子的分泌。近期研究發現，這些特殊的與EV相關的miRNA來自于腫瘤細胞，并能活化TLRs，而不是非腫瘤細胞的白細胞[62]。這些研究可能解釋了內源性的miRNA修飾了TLR活化的途徑，而正常細胞來源的miRNA并不具有這個作用。這種類似于2′-O-甲基化的修飾作用相當于TLR7/8的拮抗劑[63]。它們增加了EV相關RNA在細胞間功能轉運另一層面的復雜性。

3.5含RNA微生物的EV對固有免疫應答的調節微生物感染細胞釋放的EV具有許多重要作用。來源于感染細胞的EV經常含有能被免疫細胞識別的微生物產物。例如巨噬細胞感染微生物后增加了EV的分泌，并使得DC成熟和鄰近巨噬細胞的活化[64]。多種被病毒感染的細胞也影響了EV釋放[65,66]。對病毒而言，EV能促進或抑制病毒的傳播和/或調節宿主的抗病毒免疫應答。

多個研究表明病毒感染后的細胞所釋放的EV含有病毒RNA，而這些RNA具有調節先天免疫應答的作用。目前已知EB病毒可干擾EV的釋放。在人類皰疹病毒隱匿感染的B細胞和上皮細胞釋放的EV含EB病毒隱匿感染膜蛋白1(EBV Latent membrane protein 1,LMP1)。這種蛋白釋放到周圍非感染細胞起著免疫逃避作用[67]。另外，EB感染細胞后所釋放的EV含有病毒基因組BHRF1和BART基因簇編碼成熟的miRNA[68,69]。這種表達模式與病毒隱匿感染狀態相關。采用miRNA BHRF1-3和miR-BART15報告結構對受體細胞進行轉染，EV相關的miRNA可被功能性轉移到受體細胞，并介導了靶基因的轉錄抑制[68,70,71]。關鍵是EB病毒編碼的miR-BART15的特殊靶點是炎癥復合體(Inflammsome)的一個成分NLRP3，是炎癥初始化過程已知的產生前炎癥因子IL-1β和IL-18的多種蛋白復合物[71]。

EV的miR-BART15最初是在單核細胞THP-1中發現的，在單核細胞中NLRP3和IL-1β蛋白表達下降[71]。這個研究證明了在EB病毒感染隱匿期EV相關的miR-BART15具有調節炎癥反應的作用，通過包含有LMP1和病毒miRNA 的EV將抑制免疫活化作用轉移給了鄰近免疫細胞。

除了EB病毒感染，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染的細胞也釋放含病毒RNA的EV。HCV感染肝臟細胞釋放的EV含有完整的病毒基因組和亞基因組的RNA序列[72]。這些EV釋放給漿細胞樣DC(plasmacytoid DC,pDC)導致了TLR7依賴的干擾素反應。同樣，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)感染的細胞也釋放含LCMV-RNA的EV，并能使pDC產生IFN-α[73]。這種EV介導機制是一種阻止免疫識別病毒的策略，或者是誘導鄰近細胞失去抗病毒應答的一種宿主策略。

近年來研究表明，細菌和寄生蟲也可釋放EV，并能影響宿主與微生物的互相作用以及對免疫調節施以影響[74,75]。革蘭氏陰性菌的EV從菌體外膜脫離而被稱之為外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)[76]。多種蠕蟲也釋放EV，但它的形成和釋放機制目前尚不明確[77]。微生物的EV經常含有抗原和致病因子，包括TLR配體和NOD樣受體(NOD like receptors,NLR)，NLR能影響被感染的宿主的先天免疫應答。

目前對微生物釋放EV RNA的種類和含量仍不清楚。最近Bayor-Stantos等[77]的研究證實，克魯斯氏錐蟲來源的EV含多種sncRNA。這些EV中存在著源自tRNA的豐富的小RNA[77,78]。研究表明這種tRNA片段對多種生物學功能具有高度調節作用[79]，可大大抑制蛋白合成、Argonaute蛋白相關的基因沉默效應以及病毒活性。與EV共同培養，可以將這種特殊的tRNA直接轉染給靶細胞，并誘導參與調節宿主與寄生蟲生物學過程，如對關節炎癥細胞因子CXCL2基因編碼進行調節[80]。對來源于寄生蟲和前面所述免疫細胞的EV[37]，它們均有豐富的tRNA片段是值得重視的，這意味著EV具有跨越生命物種的特點。目前發表的EV相關的RNA深度測序研究顯示，富含tRNA片段的包括：克魯斯氏錐蟲和免疫細胞[37]、在精液中人際傳播的細菌[81]。另外，EV相關的RNA深度測序分析尿液[41]、血漿[42]、神經元細胞釋放的[34]和神經膠質瘤細胞釋放的[82]均含有tRNA序列圖譜。這些序列是否表現為tRNA片段或完整長度的tRNA還有待進一步研究。

3.6含DNA的EV對腫瘤固有免疫的調節腫瘤發生和轉移的條件之一是免疫系統的損害，但腫瘤對免疫系統，尤其是免疫監視的損害機制目前尚不清楚。免疫防御的第一道防線是固有免疫，它們通過體液免疫和肥大細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和髓系細胞等介導的成分來抵御外來入侵。因此，腫瘤發生或轉移前必然存在免疫應答的損害或免疫微環境的改變。在腫瘤進展的過程中，EV和其他被分泌的囊泡起著細胞間信息交流的作用。腫瘤細胞的EV含有大量的生物活性分子，包括：蛋白、RNA、miRNA和DNA等，它們使得T細胞免疫原性變得遲鈍或朝著固有免疫細胞表型有利于腫瘤發生的方向發展[83]。明確腫瘤進展中EV的作用對腫瘤的治療至關重要。

EV除了含有小RNA外，2010年也首次報道了它也包含了DNA。該研究對骨骼肌C2C12細胞株釋放的EV信號轉導過程中發現EV含有線粒體DNA(mtDNA)[11]。隨后，有研究者在膠質瘤細胞系的外泌體中檢測出了少量的單鏈DNA。該研究認為，腫瘤的EV含有一整套的進行水平轉錄的遺傳信息，包括：特殊編碼和非編碼的RNA、DNA、突變和癌基因擴增以及轉座子等，EV可以作為臨床腫瘤的生物學標記[84]。Kahlert等[12]對胰腺癌細胞釋放的EV中發現>10 kb雙鏈DNA片段，這些片段是KRAS和p53癌基因的突變產物，在胰腺導管癌中最多見。在全基因組測序中，研究者證明了胰腺癌患者血清的EV含有這些雙鏈DNA片段，在這篇文獻中作者討論了這些雙鏈DNA片段在臨床應用的前景。

4結論

EV組成了一個高度精細的細胞間信號交流系統，并且廣泛地被免疫細胞所利用。EV是獨特的信息攜帶者，它將選擇性的靶向信號分子組裝在單一的顆粒中，這些顆粒將這些特定的分子信息釋放給指定的受體細胞。EV中包含不同長度的非編碼RNA序列，在體外實驗中這些RNA序列能被功能性轉移給先天免疫細胞或非免疫細胞，從而影響先天免疫應答。EV-RNA介導作用包括調節前炎癥因子或抗炎癥因子的產生、細胞分化和抗病毒干擾素反應。這類EV相關RNA包括miRNA、tRNA片段以及病毒RNA等。EV介導的多種非編碼RNA進行細胞間的轉移是一種新認識的信號交流方式。腫瘤細胞以及患者血清中的EV還含有DNA片段，可能成為可利用的臨床腫瘤生物標志物，是否能成為腫瘤治療和疫苗研制的方向有待進一步研究。

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[收稿2015-05-20修回2015-06-24]

(編輯倪鵬)