自噬在腦缺血性損傷中的作用

丁 煌，唐映紅，黃小平

（湖南中醫藥大學1．分子病理實驗室，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，2．藥學院藥理學教研室，湖南長沙 410208）

自噬在腦缺血性損傷中的作用

丁 煌1，唐映紅2，黃小平1

（湖南中醫藥大學1．分子病理實驗室，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，2．藥學院藥理學教研室，湖南長沙 410208）

中國圖書分類號：R-05；R329．25；R392；R743.31

摘要：自噬是一種細胞內成分自我降解的過程，包括自噬的誘導、自噬體膜的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及內容物的降解。自噬若適度激活，則促進細胞存活；若過度激活，則可加重細胞損傷，甚至導致細胞裂解和促進細胞死亡。該文主要從自噬的形成過程及分子機制、腦缺血后自噬的誘發因素、自噬參與腦缺血的信號轉導通路及自噬在腦缺血損傷中的作用進行綜述，為進一步研究自噬與腦缺血性損傷及其藥物調控提供參考。

關鍵詞：自噬；腦缺血損傷；信號轉導通路；PI3K／Akt；AMPK；NF-κB；MAPK

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．007．html

自噬（autophagy）是細胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細胞內物質的統稱，是近年來逐漸被認識的細胞除壞死和凋亡外的第3種死亡方式［1］。在通常情況下，自噬在多數細胞內都處于一個相當低的水平［2］。當細胞受到外界因素刺激，如饑餓、缺氧、高溫或損傷、過多的細胞器和胞質成分積聚等多種情況下，則會產生過度自噬［3］。腦缺血是由于腦組織血流不足，腦細胞代謝障礙，最終導致腦細胞不可逆性損傷和死亡的一系列病理生理學過程［4］。近年來，眾多研究表明，自噬參與了腦缺血損傷的發生、發展過程。現就自噬在腦缺血性損傷中的作用綜述如下。

1　自噬的形成過程及分子機制

根據細胞物質到達溶酶體腔途徑的不同，自噬可以分為大自噬、小自噬以及分子伴侶介導的自噬3種形式。我們通常所說的“自噬”主要指大自噬，其過程可以被人為地分成4步，包括自噬的誘導、自噬體膜的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及內容物的降解［5］。

第1步，營養物質豐富（如復糖復氧）的情況下，雷帕霉素靶蛋白C1復合物（mTORC1）與哺乳動物同源物ULK復合物ULK1／2-mAtg13-FIP200-Atg101結合，促使ULK1（或ULK2）磷酸化及絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶自噬相關基因13 （autophagy-related gene13，Atg13）mAtg13的高度磷酸化，從而對自噬的誘導產生抑制作用。但是當環境營養不足（如缺糖缺氧）的情況下，mTORC1與ULK復合物ULK1／2-mAtg13-FIP200-Atg101分離，使mAtg13去磷酸化，自噬誘導開始［6－7］。第2步，磷脂酰肌醇三磷酸激酶（phosphatidylinosi-tol 3-kinase，PI3K）分為Ⅲ型，其中Ⅰ型PI3K抑制自噬的發生，而Ⅲ型PI3K促進自噬的發生。PI3K復合物由Beclin 1 （Atg6的同源物）、Ⅲ型PI3K和p150（Vps15的同源物）組成，募集胞質中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質，用于自噬體膜的形成［6－7］。第3步，Atgl2由El樣酶Atg7活化，之后轉運至E2樣酶Atgl0，最后與Atg5結合，形成自噬體前體［8－9］。微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下脫去羥基端變成LC3-Ⅰ，隨后LC3-Ⅰ被Atg7激活并轉位到Atg3，在Atg3的作用下與PE連接并酯化形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體的內膜和外膜，形成完整的自噬體。因此，常把LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ作為自噬的標志蛋白。第4步，自噬體與溶酶體的融合需要溶酶體相關膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP-1）、LAMP-2和l GTPase Rab7，但是具體的作用機制目前還不清楚。融合后，內容物開始降解，其過程主要依賴一系列溶酶體水解酶，包括組織蛋白酶B、D、L，最后內容物降解產物通過溶酶體透性膜轉到胞液中被重新利用［1，10］。

2　腦缺血后自噬的誘發因素

腦缺血后自噬的誘發因素包括由大量活性氧、自由基的釋放引起的氧化應激，通過上調自噬相關蛋白LC3、Beclinl表達從而誘導細胞自噬［11］；內質網應激即內質網（ER）內穩態失衡后，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在ER積聚［12］，通過對自噬相關信號通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制后誘導細胞的自噬［13］；海馬神經細胞的JNK活性增強后通過引起神經細胞興奮性毒性進而誘導自噬和凋亡［14］等。程序性死亡方式包括凋亡與自噬，二者作用交叉［14］。其中Bcl-2、Bcl-xl、Bax、caspase家族等基因稱為凋亡相關基因，Bcl-2蛋白水平下降能引起自噬激活，caspase對細胞自噬也具有十分重要的作用，它們可以裂解自噬相關蛋白，裂解后的蛋白碎片具有促進細胞凋亡的作用［15－16］。

3　參與腦缺血后自噬的主要信號轉導通路

自噬的調節較為復雜，有多條信號通路參與，其中主要包括mTOR、AMPK-mTORC1信號通路、核因子NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）介導的信號通路等［17］。

3．1PI3K／Akt-mTOR信號通路 mTOR是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，包括mTOR復合物1（mTOR complex 1，mTORCl）即雷帕霉素敏感型和mTOR復合物2（mTOR com-plex 2，mTORC2）即雷帕霉素欠敏感型。mTORCl是自噬的主要調節靶點，其主要調節因素包括糖和高能量狀態、各種應激以及該通路的上游信號分子；雷帕霉素和氧糖剝奪等引起的缺血缺氧情況下可穩定Raptor-mTOR的連接，抑制mTORCl的激酶活性，從而促進自噬［18］。上游信號分子主要包括PI3K／Akt中相關通路，正常情況下Beclinl可使PI3K活化，從而使得Akt在細胞膜上聚積；此時，Akt出現磷酸化，促進腫瘤抑制基因TSC2編碼的蛋白磷酸化，激活raptor-mTOR復合物和mTORCl的激酶活性，從而抑制自噬［19］。腦缺血損傷后，缺血缺氧刺激激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ），抑制Beclinl活性后，抑制PI3K和Akt的活性，從而抑制mTORCl的激酶活性，因此產生自噬［20］。

3．2AMPK-mTORC1信號通路 一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated kinase，AMPK）是能量傳感器［7］，主要由催化亞基α和調節亞基β、γ組成，真核細胞內的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶即是AMPK。大腦中大量存在催化亞基α1、α2，在能量缺乏如缺血缺氧等情況下被迅速激活，進而產生一系列的癥狀［21］。LKB1激酶和Ca2＋／鈣調蛋白依賴性激酶激酶β（Ca2＋／calmodulin-dependent protein kinase kinase-β，CaMKKβ）屬于AMPK的上游激酶［22］。有研究發現［23］，上調AMP／ATP比值或者升高Ca2＋的濃度時，CaMKKβ會出現磷酸化，從而產生磷酸化的AMPK（p-AMPK），進而抑制TSC1／2和mTORC1的活性產生自噬，調節該過程的還包括mTORC1的底物S6K1。Wang等［24］研究證實抑制自噬相關信號通路mTOR的活性產生自噬后，其下游眾多的靶蛋白及信號通路如mTORC1-4E-BPs激活和TSC2-mTOR-S6K1抑制，影響蛋白質翻譯、核糖體合成等代謝過程，從而參與腦缺血／再灌注后神經細胞的自噬性死亡或加重細胞的自噬性損傷。

3．3NF-κB信號通路 哺乳動物核因子（NF）-κB的家族成員包括p50／p105（NF-κB1）、p52／p100（NF-κB2）、c-Rel、RecB、p65（RecA）等。正常情況下，NF-κB位于胞質中并與其抑制蛋白（IκB）緊密結合。當細胞受到缺血缺氧等因素刺激時［25－26］，激活后的NF-κB從胞質轉移到胞核中，進而上調p62蛋白的表達，從而使得p53、IκBα和Bcl-2表達減弱，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和Beclinl的表達增強，從而產生自噬。Li等［25］為了誘導局灶性腦缺血模型，采用NF-κB基因敲除小鼠，并對其大腦中的動脈遠端分支結扎，結果發現NF-κB途徑可調控腦缺血誘導的自噬樣損傷。Cui等［27］研究發現在大鼠海馬區經過缺血／再灌注損傷后，信號轉導通路NF-κB-p53參與損傷處相關的自噬與凋亡。

3．4MAPK介導的信號通路 細胞外信號調節激酶（ex-tracellular signal-related kinase，ERK）、氨基末端激酶（Jun NH2 terminal kinase，JNK）和p38［28］構成了MAPK。mTORC1是其下游調節分子，有研究發現［24］，在腦缺血／再灌注中的缺血缺氧刺激下，MAPK-mTOR信號通路能夠降低LC3、Bec-lin-1和抗胸腺細胞球蛋白等自噬相關蛋白的水平，使得ERK、Akt、磷酸肌醇依賴性激酶（PDK1）的活性受到抑制，進而激活mTOR、JNK、p38、蛋白絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶（PTEN）的活性，從而產生自噬。

3．5其它 此外，調節和誘導自噬的途徑還包括信號轉導通路p53［29］，Ras／蛋白激酶A（PKA）和毛細血管擴張性共濟失調突變蛋白激酶（ATM）mTOR［30］，以及Bcl-2與Beclinl復合體［31］等。

4　自噬在腦缺血性損傷中的作用

研究證明，細胞損傷的嚴重程度直接關系到自噬在腦缺血性損傷中的作用。在輕度饑餓、缺氧等情況下，自噬不僅通過降解蛋白提供能量，而且能夠通過降解損傷的蛋白后合成新的蛋白，從而保護著機體的細胞［2］。若重度饑餓、缺氧，或延長細胞損傷的時間，激活凋亡相關調控蛋白產生凋亡后，自噬也過度激活，過度激活的自噬又進一步促進凋亡的發生，從而對機體產生損傷作用［3］。

4．1自噬減輕腦缺血損傷 有研究表明，自噬可保護神經細胞，減輕缺血性損傷。Carloni等［32］通過對新生1周SD大鼠腦部缺糖缺氧后發現，短時間內即可產生自噬，用自噬抑制劑三甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和渥曼霉素（wortmannin，WM）抑制自噬后，壞死的細胞數量增多，而自噬激動劑雷帕霉素使細胞壞死和凋亡明顯減少，且證明是通過PI3K-Akt-mTOR通路對缺血后的損傷發揮保護作用。Chauhan等［33］通過建立大鼠局灶性腦缺血模型和原代海馬神經細胞缺糖缺氧損傷即氧糖剝奪（oxygen-glucose depriva-tion，OGD）模型，并采用MRI成像觀察，發現大鼠缺血后1 h腹腔注射雷帕霉素可以使得腦梗死的體積減少，過氧化物歧化酶、谷氨酸等的釋放受到抑制，海馬神經細胞OGD后產生自噬并一直能持續至復糖復氧后的48 h，用自噬抑制劑3-MA抑制自噬后，OGD模型的損傷加重，進而從體內和體外水平證明自噬對該細胞造模后的損傷具有保護作用。Sheng等［34］證實缺血預適應（ischemic preconditioning，IPC）可誘導神經細胞自噬，自噬抑制劑抑制自噬后可增加腦的梗死體積和水腫程度。而自噬激動劑雷帕霉素作用后的效果則相反，其保護作用的發生過程主要通過IPC的直接保護神經細胞以及上調熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）的表達，并已證實HSP70對細胞具有保護作用。Yan等［35］對大鼠制備高壓氧預適應模型，發現自噬激動劑雷帕霉素產生自噬后，能模擬高壓氧預適應的生物學效應，從而減輕腦缺血性損傷。Balduini等［36］研究發現，缺血缺氧等應激狀態下的細胞存活較低，若自噬發生后，其存活率會明顯提高，因此認為自噬在應激狀態下對細胞產生保護作用。丁培炎等［37］以短期禁食誘導大鼠腦局灶性缺血／再灌注模型，研究其損傷的作用，發現短期禁食后產生自噬，自噬能減輕該模型引起的損傷作用，因此證明該模型中自噬對細胞具有保護作用。Wang等［38－39］研究腦缺血后自噬產生神經保護作用的主要機制，發現煙酰胺轉磷酸核糖激酶和ARRB1／β-arrestin-1是其分子機制的主要作用基礎，且該分子同時作用于BECN1與自噬。高博等［40］通過制備局灶性腦缺血預適應模型，采用兩次插入線栓法引起內質網應激并誘導出自噬，發現自噬在該模型中起保護作用，且用內質網應激抑制劑SAL能阻斷該保護作用，猜測SAL阻斷內質網應激后，抑制了自噬的活性，從而阻斷了相關的保護作用。王燕梅等［41］通過短暫全腦缺血和短暫全腦缺血－低氧處理建立短暫全腦缺血模型后，比較海馬CA1區中自噬相關蛋白LC3、LAMP2和組織蛋白酶D的蛋白表達情況，發現低氧后處理產生的自噬對短暫全腦缺血起保護作用。

4．2自噬加重腦缺血損傷 另有研究證實，自噬可加重腦缺血損傷。Wen等［42］通過對大鼠建立永久性腦缺血模型，發現缺血后即能產生大量的自噬，并且自噬抑制劑3-MA和組織蛋白酶抑制自噬后，腦梗死體積減少，神經自身修復功能增強，提示該損傷產生的自噬可加重腦缺血引起的損傷。Puyal等［43］對新生12d的大鼠通過短暫性左側大腦中動脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）造成局灶性腦缺血，發現損傷后可產生細胞的壞死、凋亡和自噬，在再灌注起始及3h后注射自噬抑制劑3-MA，自噬抑制并且腦梗死體積明顯減少，因此認為自噬在局灶性腦缺血損傷中可加重腦缺血損傷。Wang等［44］建立大鼠全腦缺血模型，并觀察海馬CAI區神經細胞，發現自噬抑制劑3-MA在缺血前1h或0．5h加入，全腦缺血引起的神經元損傷能明顯減輕。Zheng等［45］利用RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）使得腦缺血大鼠體內自噬相關基因Beclin l表達下調，自噬抑制，皮質和紋狀體處神經細胞損傷減輕，能抑制神經細胞的凋亡并可觀察到大量神經細胞再生，提示自噬在該模型中可加重腦缺血損傷。Koike等［46］利用ATG-7缺陷的新生小鼠制作腦缺血模型，抑制了腦缺血中產生的自噬，結果發現ATG缺陷可保護腦缺血后海馬區神經細胞引起的一系列損傷。石秋艷等［47］對大鼠大腦中動脈缺血1 d、3 d、5 d后再灌注，觀察該時間對海馬自噬的影響，結果發現自噬水平下調后缺血／再灌注損傷減輕。Xu等［20］發現抑制自噬后，可減輕腦缺血后的神經損傷，且PPAR-γ的激動劑15脫氧前列腺素J2（15-deoxy prostaglandin J2，15d-PGJ2）是其發揮神經保護作用主要分子基礎。Shi等［48］對原代皮質神經元細胞和人神經上皮瘤細胞（SH-SY5Y）模擬體外腦缺血模型，發現自噬在缺糖缺氧6 h后，復糖復氧24、48和72 h后產生，并且該模型使得自噬過度激活，從而引起腦缺血后相關的神經細胞死亡，加重腦缺血引起的損傷。Jiang等［49］研究表明，自噬抑制劑3-MA抑制自噬后，腦缺血產生的一系列炎癥可通過NF-κB通路調節抑制，從而減輕了腦缺血后的損傷。Gao等［50］研究表明腦缺血損傷后，抑制自噬相關的信號通路可減輕該損傷，并產生神經保護作用。

5　結語

綜上，自噬既有利又有弊［51］。自噬適度能使體內異常蛋白質及受損或過多的細胞器得到清除，從而維持著細胞的存活、分化、發育和穩態；而過度的自噬，可引起自噬性細胞死亡，并和細胞死亡的另兩種形式凋亡、壞死交互作用，使細胞損傷加重。因此，研究腦缺血后自噬的相關作用，了解自噬的發生、發展過程，認清自噬發生的相關調節因素及信號通路，有助于根據自噬的特點和功能，針對腦缺血的治療方式，發現新的治療靶點和策略。

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Effects of autophagy in cerebral ischemic injury

DING Huang1，TANG Ying-hong2，HUANG Xiao-ping1
（1．Molecular Pathology Laboratory，Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-Cerebral Diseases，Key Laboratory of Hunan Universities for Cell Biology and Molecular Techniques；2．Dept of Pharmacology in Pharmacy College，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract：Autophagy，a process of intracellular component deg-radation，consists of initiation，vesicle membrane，vesicle ex-pansion and completion，vesicle fusion and autophagosome deg-radation．Moderate activation of autophagy may promote cell sur-vival，while excessive activation of autophagy may aggravate cell injury，or even lead to cell lysis and death．This paper mainly reviews the process and the molecular basis of autophagy，as well as trigger factors，signal transduction pathways involved in cere-bral ischemia，along with its effects on ischemic brain injury，which will provide a reference for further probe of autophagy in cerebral ischemic injury and its drug regulation．

Key words：autophagy；cerebral ischemic injury；signal trans-duction pathway；PI3K／Akt；AMPK；NF-κB；MAPK

作者簡介：丁 煌（1990－），女，碩士生，研究方向：心腦血管疾病的藥理機制，E-mail：287351273＠qq．com；黃小平（1974－），女，博士生，副教授，碩士生導師，研究方向：心腦血管疾病及中藥組（成）分配伍，通訊作者，Tel：0731-88458201，E-mail：jialeliu＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81102557）；湖南省高校創新平臺開放基金資助項目（No 14K068）；湖南省科技廳一般項目（No 2014SK3001）；中醫內科重大疾病防治及成果轉化省部共建教育部重點實驗室開放課題（No ZYNK201405）；湖南省中醫藥管理局重點項目（No 201301）；“中西醫結合防治心腦血管疾病的相關基礎研究”湖南省高校科技創新團隊；“中醫藥防治心腦血管疾病基礎研究”湖南省自然科學創新群體基金

收稿日期：2015－04－29，修回日期：2015－06－10

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1048－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．004