蘋(píng)果、梨輪紋病研究進(jìn)展

顧雪迎，王洪凱，郭慶元*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052;2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310058)

蘋(píng)果和梨是世界范圍內(nèi)深受消費(fèi)者喜愛(ài)的水果之一，中國(guó)是世界上蘋(píng)果和梨的最大生產(chǎn)國(guó)，目前，我國(guó)蘋(píng)果種植面積和總產(chǎn)量都位居世界第一［1］。梨的栽培面積、產(chǎn)量、出口量及品種數(shù)量等也均居世界前列，在我國(guó)，梨僅次于蘋(píng)果、柑橘，位居第三［2］。

輪紋病是蘋(píng)果、梨生產(chǎn)中的主要病害之一，不但在田間侵染枝干、果實(shí)和葉片，還可引起果實(shí)采后腐爛，造成貯藏期爛果，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量，成為貯藏期的重要病害［3］，帶來(lái)巨大損失，嚴(yán)重時(shí)可給果園造成毀滅性破壞。該病在世界各蘋(píng)果、梨產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，我國(guó)以南方地區(qū)最為嚴(yán)重［4-5］。本文對(duì)近年來(lái)關(guān)于蘋(píng)果和梨輪紋病的病原特性、發(fā)病規(guī)律、抗病機(jī)制及防治措施等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 病原

輪紋病病原有性態(tài)是Botryosphaeria dothidea，屬子囊菌，無(wú)性態(tài)為樹(shù)殼梭孢菌 (Fusicoccum aesculi)［6-8］。輪紋病菌侵染梨或蘋(píng)果，引起果實(shí)輪紋爛果，多年生枝干粗皮，小枝條潰瘍等癥狀，并導(dǎo)致干枯死亡［9］。關(guān)于輪紋病菌的鑒定與命名，歷史上曾有爭(zhēng)議。1907年日本首先報(bào)道在梨和蘋(píng)果上發(fā)現(xiàn)輪紋病［10］;1925年原攝祐命名為Macrophoma kawatsukai Hara［11］;1933 年野瀨直毅發(fā)現(xiàn)其有性世代，定名為Physalospora piricola Nose［12］。1980年，小金澤碩城和佐久間勉進(jìn)行重新鑒定，認(rèn)為其致病菌為Botryosphaeria［13］，并于1984年提出，蘋(píng)果輪紋病菌與干腐病菌在形態(tài)上極為相似，應(yīng)屬同種，因其致病性存在一定差異，提議將其作為干腐病菌的一個(gè)專化定名為Botryosphaeria berengeriana de Not. f. sp. piricola (Nose)Koganezawa et Sakuma。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鄭儒永教授將其中文名擬名為貝倫格葡萄座腔菌梨生專化型 (B．berengeriana f.sp.piricola)［14］。

近年來(lái)，經(jīng)生物學(xué)特性研究、酯酶同功酶比較及RAPD基因組多態(tài)性分析，指出輪紋病菌與干腐病菌親緣關(guān)系較近，但存在明顯的差異［15-16］。余仲東等［17］從ITS-rDNA-PCR-RFLP方面研究發(fā)現(xiàn)輪紋病菌具有有別于干腐病菌的210 bp的特征性譜帶，可以此作為2種致病菌的劃分依據(jù)。近年來(lái)結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析，確定了蘋(píng)果、梨輪紋病的致病菌屬于同一個(gè)種，都是B．dothidea［8-9］。

2 生物學(xué)特性

2.1 菌絲生長(zhǎng)條件

輪紋病菌在多種天然及半合成培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，其菌絲的最適生長(zhǎng)溫度為25～28℃，最適pH范圍為7～8。其菌絲生長(zhǎng)的最適碳源為蔗糖，最適氮源為天門冬素和硝酸鈉，L-半胱氨酸對(duì)菌絲有明顯的抑制作用［18］。

2.2 分生孢子器的形成及成熟條件

輪紋病菌的分生孢子器在15～35℃均可產(chǎn)生，低于15℃或高于35℃時(shí)不易形成，其最適溫度為25℃。在pH 4～10時(shí)均可形成分生孢子，其適宜的pH范圍為5～8，而pH值5的弱酸性環(huán)境最利于分生孢子器的產(chǎn)生及成熟［18-19］。分生孢子器的形成必須依賴碳素營(yíng)養(yǎng)，無(wú)碳素則不能形成，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上形成的子實(shí)體最多。另外，分生孢子器的形成必須在光照條件下完成，黑暗條件下不能形成成熟的分生孢子器，360～400 nm短光波黑光燈照射培養(yǎng)有利于分生孢子器的形成［18］。

2.3 分生孢子的萌發(fā)

分生孢子在自由水中，溫度達(dá)到15℃以上即可萌發(fā)，但其最適萌發(fā)溫度為28℃［15］。在寄主的果、葉組織液中孢子萌發(fā)率明顯增高［18］。

3 發(fā)病規(guī)律

輪紋病菌以菌絲體、分生孢子器及子囊殼在被害枝干上越冬，成為次年初侵染和連續(xù)侵染的主要菌源。病原菌主要通過(guò)植物皮孔侵入［20］，也可通過(guò)表面裂隙侵入，非皮孔部位的發(fā)病可能是由毛狀體脫落痕侵入引起［21］，侵染后往往表現(xiàn)出明顯的潛伏侵染特性［7］。輪紋病菌侵染果實(shí)時(shí)，分生孢子與果實(shí)接觸，溫、濕度適宜時(shí)萌發(fā)產(chǎn)生芽管，頂部膨大形成附著胞，侵入皮孔后菌絲擴(kuò)展受抑制，潛伏在皮孔周圍組織中。早期侵入潛伏期達(dá)80～150 d，晚期侵入僅為18 d左右。當(dāng)果實(shí)進(jìn)入成熟期，生理狀況發(fā)生改變，如釋放出可溶性養(yǎng)分或抑菌物質(zhì)濃度降低時(shí)，病菌結(jié)束潛伏，生出入侵錐，并在機(jī)械作用和真菌水解酶作用下入侵果實(shí)［20-21］，病菌入侵后，菌絲主要分布于寄主細(xì)胞壁、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間隙及細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間。菌絲侵入成熟果實(shí)，一般造成細(xì)胞質(zhì)變性和細(xì)胞器破壞，并伴隨著細(xì)胞壁的降解［22］。

與蘋(píng)果輪紋病的研究相比，梨輪紋病的研究相對(duì)較少。蘋(píng)果輪紋病在其潛伏侵染時(shí)，菌絲細(xì)胞中形成微體-脂肪粒復(fù)合體，儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)，并通過(guò)乙醛酸循環(huán)，提供能量和酶類，使病菌抵抗不良環(huán)境并度過(guò)潛伏侵染階段，在條件適宜時(shí)結(jié)束潛伏狀態(tài)，完成侵染，引起發(fā)病［23］。蘋(píng)果輪紋病菌能在培養(yǎng)基及活體內(nèi)產(chǎn)生一系列果膠酶，其中多聚半乳糖醛酸酶 (PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶 (PMG)參與致病過(guò)程［4］。

4 抗病機(jī)制研究

4.1 組織結(jié)構(gòu)與抗病性關(guān)系

皮孔是病原菌侵染、傳播的主要部位及病原菌潛伏的重要部位。有研究報(bào)道，皮孔的密度及大小影響著輪紋病的發(fā)病情況，可用皮孔密度或皮孔密度×直徑作為鑒定輪紋病抗性的指標(biāo)［24］。在接種試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，枝干輪紋病病斑在皮孔部位發(fā)病率達(dá)92%，從而證實(shí)了關(guān)于皮孔是主要侵入途徑的推測(cè)［25］。孫月麗等［26］通過(guò)對(duì)幾種蘋(píng)果砧木雜交后代及其父母本的皮孔性狀調(diào)查和抗病菌侵染力測(cè)定，證明皮孔密度與面積之積與侵染率之間存在極顯著正相關(guān)。

病原菌感染后的細(xì)胞壁發(fā)生木質(zhì)化是寄主在侵染過(guò)程中的抗性反應(yīng)，木質(zhì)素的沉積可加強(qiáng)細(xì)胞壁的木質(zhì)化，阻止病原菌的擴(kuò)散，切斷病原菌營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，鈍化真菌生長(zhǎng)點(diǎn)，抑制其生長(zhǎng)繁殖;也可減少真菌的細(xì)胞壁降解酶與多糖接觸，從而減少細(xì)胞壁降解，增強(qiáng)抗病性［27］。許多研究結(jié)果都證實(shí)了木質(zhì)化反應(yīng)是植物抵抗病菌侵染的最有效的手段之一［28］。

4.2 抗病生化因子

4.2.1 糖酸類

糖類與酸類是果實(shí)中主要的代謝物質(zhì)，也影響著病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育。果實(shí)中總含糖量與果實(shí)發(fā)病呈正相關(guān)，而果實(shí)總酸度則與果實(shí)發(fā)病呈負(fù)相關(guān)［29］。推測(cè)原因是因?yàn)樘穷愇镔|(zhì)可為病菌的生長(zhǎng)提供碳源和氮源［30］，有利于病菌的生長(zhǎng);而酸類物質(zhì)則有利于組織細(xì)胞的木質(zhì)化而對(duì)病菌有抑制作用。果實(shí)采后糖含量升高，而各種有機(jī)酸和總酸含量呈下降趨勢(shì)，致使病原菌從潛伏態(tài)發(fā)展為發(fā)病態(tài)［31］。但在對(duì)鴨梨中有機(jī)酸抗病性研究中發(fā)現(xiàn)，奎寧酸可以抑制病原菌的生長(zhǎng)，但濃度較低時(shí)反而促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)［32］。

4.2.2 酚類物質(zhì)

酚類化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，酚類物質(zhì)的快速積累可減緩 (甚至停止)病原菌的生長(zhǎng)，對(duì)植物的抗病性起重要作用［33］。在離體條件下，部分酚類化合物達(dá)到一定濃度時(shí)對(duì)病菌菌絲的生長(zhǎng)、分生孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)及附著孢的形成有抑制作用［34］。研究表明，蘋(píng)果果實(shí)的總酚含量在幼果期、膨大期、成熟期都與蘋(píng)果輪紋病的發(fā)生程度呈顯著負(fù)相關(guān)，劉海英等［35］認(rèn)為果實(shí)中酚類物質(zhì)對(duì)輪紋病病菌侵入有顯著的抑制作用，可抑制病原菌的生長(zhǎng)。果實(shí)中酚類物質(zhì)的成分及含量由遺傳因素及生長(zhǎng)環(huán)境所決定，同時(shí)也受采后貯藏和加工過(guò)程的影響［36］。如蘋(píng)果品種紅玉中酚類物質(zhì)含量較高，其抗性就較強(qiáng);而酚類物質(zhì)含量較少的金冠則抗病性較弱。

4.2.3 相關(guān)酶類

在植物抵抗病原微生物侵染的過(guò)程中，抗性相關(guān)酶起著重要的作用，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶 (POD)和苯丙氨酸解胺酶(PAL)［37］。其抗性表現(xiàn)為:POD通過(guò)催化木質(zhì)素的合成促進(jìn)細(xì)胞壁的木質(zhì)化，抵制病原菌的侵染;POD主要通過(guò)催化木質(zhì)素及將酚類物質(zhì)氧化為對(duì)病原菌有更大毒性的醌類物質(zhì)，來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，也可通過(guò)形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用。PAL是苯丙烷類代謝 (病原菌入侵時(shí)植物細(xì)胞的特征反應(yīng))的關(guān)鍵酶和限速酶，在木質(zhì)素的積累、植保素和酚類物質(zhì)的合成中起重要作用。鴨梨果實(shí)貯藏期對(duì)病原菌抗性下降與SOD，POD，PAL等酶活力的下降密切相關(guān)［38］。?

4.3 防御相關(guān)基因

對(duì)蘋(píng)果基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并結(jié)合半定量PT-PCR和熒光定量技術(shù)對(duì)防御相關(guān)基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)響應(yīng)輪紋病病原菌侵染的基因。對(duì)這些基因進(jìn)行基因功能分析時(shí)發(fā)現(xiàn):MdPR-4-1通過(guò)編碼抗菌蛋白，直接抑制病原菌的生長(zhǎng)，且該基因的抑菌作用具有廣譜性;MdMBP2則可能編碼識(shí)別蛋白，通過(guò)參與對(duì)病原菌的識(shí)別作用參與對(duì)蘋(píng)果輪紋病的防御反應(yīng)，熒光定量PCR結(jié)果顯示，該基因在皮和葉中的表達(dá)量較高。另外，MdACBP2基因的表達(dá)還能被輪紋病病原菌侵染所抑制，且不同脅迫處理的結(jié)果表明，該基因能被B．dothidea侵染和10%PEG滲透脅迫所抑制，但低溫可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，推測(cè)該基因可能參與了蘋(píng)果對(duì)生物或非生物脅迫的抗性反應(yīng)［39］。

5 防治措施

輪紋病菌為弱寄生菌，因此，輪紋病的發(fā)生與樹(shù)勢(shì)強(qiáng)弱關(guān)系密切。對(duì)于輪紋病的防治，應(yīng)在加強(qiáng)栽培管理、增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)、提高樹(shù)體抗病能力的基礎(chǔ)上，進(jìn)行藥劑防治。藥劑一般采用波爾多液、代森錳鋅、多菌靈等。袁自更［40］從田間管理、藥劑防治及果實(shí)儲(chǔ)藏等方面詳細(xì)論述了蘋(píng)果輪紋病的防控措施。遲福梅等［41］通過(guò)室內(nèi)殺菌劑毒力試驗(yàn)表明，10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原菌的抑菌效果最佳，其次為43%戊唑醇懸浮劑。

隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注及環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，以及對(duì)農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性等問(wèn)題認(rèn)識(shí)的加深，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始致力于尋找和開(kāi)發(fā)安全高效的生物農(nóng)藥。枯草芽孢桿菌B-903是趙白鴿等［42］從蘋(píng)果樹(shù)皮上分離獲得的一種光譜拮抗菌株，其對(duì)離體的蘋(píng)果輪紋病菌株有明顯的抑菌效果，經(jīng)田間噴淋保護(hù)和水果貯前浸果處理結(jié)果表明，該菌株對(duì)輪紋病菌有明顯的抑制作用。紀(jì)兆林等［43］從土壤中分離獲得的地衣芽孢桿菌W10，對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的抑制及防效試驗(yàn)結(jié)果表明，W10菌液、培養(yǎng)濾液、抗菌蛋白對(duì)病菌的形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和分生孢子的萌發(fā)都具有明顯的破壞或抑制作用。分離篩選獲得的拮抗細(xì)菌No.1［44］和生防放線菌［45］等也均對(duì)輪紋病菌有很好的拮抗作用，而且生防菌與NaHCO3協(xié)同作用可提高生防菌對(duì)輪紋病采后防治的效果［46］。同時(shí)，苦參堿提取物［47］及植物內(nèi)生代謝物鮑曼菌素［48］等植物源農(nóng)藥也對(duì)輪紋病有較好防效。

6 問(wèn)題與展望

輪紋病是蘋(píng)果和梨生產(chǎn)上的重要病害，可引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然在病原分化、寄主抗性機(jī)理、藥劑篩選方面取得了一定進(jìn)展，但是基礎(chǔ)研究相對(duì)并不深入，對(duì)輪紋病的防治效果并不理想，需要進(jìn)一步加大研究投入，為病害的有效防治打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子遺傳學(xué)手段研究植物病害取得了很大發(fā)展。但輪紋病的致病機(jī)理研究還處于初級(jí)階段，基因水平研究輪紋病的致病機(jī)理還未見(jiàn)報(bào)道。研究輪紋病菌致病的分子機(jī)制有利于深入了解輪紋病發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)情況，為制定相應(yīng)的防治策略提供科學(xué)依據(jù);可以開(kāi)發(fā)分子靶標(biāo)，為新型農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供藥物靶點(diǎn)，促進(jìn)新農(nóng)藥的研發(fā)。特別是輪紋病菌基因組序列的發(fā)表公布，為輪紋病菌功能基因組學(xué)的研究開(kāi)辟了道路。當(dāng)前需要建立穩(wěn)定高效的輪紋病菌的基因轉(zhuǎn)化體系，充分借鑒當(dāng)前生物學(xué)發(fā)展的新技術(shù)和新成果［49-52］，深入開(kāi)展輪紋病的基礎(chǔ)研究。

雖然有效的田間管理可以降低輪紋病的發(fā)生，但是輪紋病依然是蘋(píng)果和梨貯藏期的重要病害，可造成嚴(yán)重的爛果損失。因此，在深入研究輪紋病菌致病機(jī)理的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型的高效農(nóng)藥，是病害防治的關(guān)鍵。生物防治是很好的研究方向，也取得了一些進(jìn)展，但如何確保生物農(nóng)藥在田間使用的高效性，及植物源農(nóng)藥的儲(chǔ)存及生產(chǎn)，都是目前迫切需要解決的問(wèn)題。因此，在不斷篩選新的高效的生防菌種的同時(shí)，合適的配套施用技術(shù)的研究也是安全持續(xù)有效防治輪紋病貯藏期為害的關(guān)鍵。

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