miR-208和miR-499與心血管病研究進展

miR-208和miR-499與心血管病研究進展

陳耽李驪華

(重慶醫科大學附屬第一醫院心血管科，重慶400016)

關鍵詞〔〕miR-208；miR-499；心血管病

中圖分類號〔〕R54〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家臨床重點專科建設項目經費資助(No.財社〔2011〕170號)

通訊作者：李驪華(1970-)，女，博士，碩士生導師，主要從事冠心病動脈粥樣硬化研究。

第一作者：陳耽(1990-)，男，在讀碩士，主要從事冠心病缺血心肌保護研究。

microRNA(miRNA)是一類由20~25個核苷酸組成的在進化上高度保守的內源性小分子單鏈非編碼RNA。主要通過與靶mRNA的3′-非編碼區(3′-UTR)的特異性序列堿基互補配對結合，產生轉錄后抑制，從而調控基因的表達〔1〕。miRNA在高等生物生命活動中扮演重要角色，參與生物細胞增殖、分化、免疫、應激、凋亡、癌變等多種生命過程，并在腫瘤發生及心血管病等各種疾病中起到至關重要的作用。

1miR-208、miR-499與MyomiRs家族

MyomiRs家族即肌球蛋白基因內含子編碼的miRNA家族，包括miR-208a、miR-208b、miR-499，其編碼基因分別位于(Myh)6/a組織相容性復合體(MHC)、Myh7/βMHC、Myh7b的內含子內。并反過來調節肌球蛋白基因表達和肌肉對生理病理信號的反應〔2〕。在生長發育不同階段其表達不同，β-MHC/miR-208b在胎兒小鼠心臟高表達，而隨著小鼠發育表達下降，成年小鼠幾乎不表達；而a-MHC/miR-208b正好相反，在胎兒小鼠幾乎不表達，隨著小鼠發育表達增加，成年小鼠達高峰；myh7b/miR-499則一直保持較高水平。且miR-208a具有心臟特異性，幾乎只在心臟表達，而miR-208b和miR-499在心臟和骨骼肌均有表達〔3〕。人類myh6和myh7基因串聯在染色體14 q12上，miR-208a和miR-208b具有大量相同的重復序列，且miR-208在物種間具有高度保守性。

miR-208a對β-MHC/miR-208b和myh7b/miR-499的表達具有上游調控作用，miR-208不僅調控在應激和甲狀腺功能減退時β-MHC/miR-208b的表達，也調控myh7b/miR-499在成人心臟的表達。在miR-208a-/+成年小鼠心臟myh7b和miR-499的表達下降50%；而在miR-208a-/-成年小鼠心臟myh7b和miR-499幾乎不表達。此外，在miR-208a-/-小鼠心臟強制表達miR-499時足以激活β-MHC/miR-208b 的表達及抑制快肌基因的異位表達，這表明miR-499是miR-208a發揮作用的一個下游效應介質〔2〕。肌球蛋白基因不僅編碼主要的肌肉收縮蛋白，同時通過內含子中MyomiRs家族的miRNA網絡控制肌肉的基因表達和性能，在心血管系統發揮重要的作用。

2miR-208a

人類miR-208a的編碼基因位于第14號染色體上的a-MHC基因的第27個內含子內。

2.1miRNA-208a與心肌肥厚van Rooij等〔3〕研究發現miR-208是心肌肥厚、纖維化的重要調控因子。在應激和甲狀腺功能減退的情況下miR-208通過與甲狀腺素受體相關蛋白(Thrap1)靶基因的3′-UTR結合，轉錄后抑制Thrap1表達，從而使β-MHC表達增加，進而促進心肌肥厚和心肌纖維化。此外，Montgomery等〔4〕還推斷miR-208通過調節多種β-MHC轉錄抑制因子如Sox 6、Purβ、Sp3和 HP1β的表達，使β-MHC上調。

Callis等〔5，6〕發現，miR-208實際上是肌球蛋白miRNA家族中的一員，分miR-208a和miR-208b兩個亞型。在心臟超表達會誘發心肌細胞(CMs)增生性生長，并發現除Thrap1 外，miR-208a還以肌肉生長抑制素基因(myostatin)為靶標，負性調節心肌的生長和肥大。Montgomery等〔7〕也發現miR-208a通過介導轉錄阻遏蛋白，調控應激刺激下的心臟基因表達。Thrap1是miR-208a的主要靶標。通過給予miR-208a抑制劑使miR-208a減少，Thrap1表達上調，通過阻斷下游的應激應答基因的激活而使β-MHC表達下調，延緩高血壓大鼠心功能障礙的進程。表明miR-208a在病理性心臟重塑中起重要作用。

2.2miRNA-208a與心臟傳導Callis等〔5〕研究顯示，miR-208a過表達容易引起的心律失常，在miR-208a基因敲除小鼠的心電圖中，約80%的QRS波前p波消失，表明miR-208a基因敲除小鼠容易發生心房顫動。連接蛋白(Cx)40缺乏易導致心臟傳導缺陷，Cx 40的表達僅限于心房和構成希氏束、浦肯野纖維的心肌細胞〔8〕。與野生型相比miR-208a-/-小鼠 Cx 40的轉錄水平明顯下降，表明Cx 40的表達需要miR-208a參與。除了調節Cx 40的表達，miR-208a還可以直接抑制轉錄因子GATA4和Hop在成人心臟傳導系統的表達〔5〕，在miR-208a-/-小鼠心臟GATA4表達上調而Hop表達下調，表明GATA4可能是miR-208a的直接靶標之一，而Hop通路間接受miR-208a調控。并發現與野生型相比miR-208a-/-小鼠Hop通路的轉錄水平和蛋白表達水平均降低。同時有數據表明〔9〕，Hop直接作為Nkx2.5下游效應元件發揮功能，通過同源重組使Hop失活可導致心肌發育嚴重缺陷而使部分胚胎致死。

2.3miRNA-208a與代謝Zhang等〔10〕實驗發現高濃度胰島素使得血管平滑肌細胞(VSMC)中miR-208上調，進而促進 VSMC 異常增殖，而抑制miR-208 表達將阻斷胰島素促 VSMC 增殖的作用。而后通過生物信息學預測等方法發現 miR-208可作用于下游靶蛋白 p21，對p21發揮轉錄后負性調控作用，抑制 p21 表達，提示高濃度胰島素可通過增加miR-208的表達，間接抑制 p21 表達，進而促進 VSMC 增殖。

Grueter等〔11〕研究發現心臟通過中介因子復合體的亞基中介因子復合體亞基(MED)13控制甲狀腺激素和其他核激素受體的轉錄調節全身能量平衡。MED13又受心臟特異性miRNA，miR-208a的負性調節作用。心肌特異性超表達MED13或通過藥物下調miR-208a可使小鼠抵抗高脂飲食誘導的肥胖和改善全身胰島素敏感性和葡萄糖耐受性。相反，CMs MED13基因缺失將導致高脂飲食誘導的肥胖增強并使代謝綜合征加劇。MED13通過增加能源消耗和調控許多基因參與心臟的能量平衡而產生代謝活動。這些研究結果揭示了心臟在控制全身代謝方面的作用并提示MED13和miR-208a可作為治療代謝紊亂的潛在靶點。

3miR-499

人類miR-499的編碼基因位于第20號染色體上的Myh7b基因的第20個內含子內。miR-499一般與Myh7b協同表達，主要表達于心肌及骨骼肌慢肌纖維，其他組織亦有少量表達。研究〔12~18〕發現miR-499在心臟發育、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷，心肌肥厚及心力衰竭等病理生理過程中發揮重要作用。

3.1miR-499與CMs增殖及分化miR-499在心臟的發育分化過程中及正常生理情況下大量表達。Wilson等〔12〕通過微陣列法分析H7人類胚胎干細胞(hESC)源性心肌細胞(hESC-CMs)發現高表達的miR-499使胚體心臟轉錄因子肌細胞增強因子(MEF)2C顯著上調，而MEF2C是心臟收縮基因激活和心臟結構形成的重要轉錄因子，表明miR-499可能是人類胚胎干細胞特異性分化的重要因子。

Sluijter等〔13〕在體外分離培養胎兒心肌祖細胞(CMCPs)向CMs分化過程中，檢測到肌肉特異性miR-499顯著上調。通過瞬時轉染miR-499后發現CMCP的增殖率下降了15%，但增強了CMCP和hESC向成熟心肌細胞的定向分化。顯示miR-499可通過抑制Sox 6，使Sox 6蛋白含量減少和小干擾核糖核酸(siRNA)介導的Sox 6沉默，強烈誘導CMCPs肌源性分化。

Zhang等〔14〕通過構建miR-499慢病毒轉染大鼠骨髓間充質干細胞發現，miR-499增加心臟的特定基因Nkx2.5、GATA4、MEF2C、心肌肌鈣蛋白(cTnI)的表達，降低β-catenin的磷酸化/去磷酸比率進而激活Wnt/β-catenin信號通路，誘導大鼠骨髓間充質干細胞向CMs分化。

Hosoda等〔15〕發現miR-499也影響人心肌干細胞(hCSCs)向成熟CMs的分化。miR-499在hCSCs幾乎檢測不到，但在有絲分裂后的CMs中高水平表達。miR-499可穿過細胞間隙連接通道，并進入到鄰近的hCSCs細胞內，通過siRNA抑制Sox 6和rod1靶基因的合成而發揮功能使GATA4和Nkx2.5表達增加進而促進hCSC分化。此外miR-499不僅影響胚胎期CMs分化，在心肌損傷后細胞修復過程中也起著重要作用。體外培養高表達miR-499的hCSCs并注入到動物心肌梗死邊緣區，發現梗死區CMs再生及化分明顯增加，且心功能明顯改善。

3.2miR-499與CMs凋亡心臟的功能是高度依賴于ATP的產生，所以CMs富含大量線粒體，以提供心肌所需的能量。線粒體不斷進行融合和裂變以維持細胞器活性。但異常線粒體裂變會參與細胞凋亡的啟動，引起心肌梗死中細胞凋亡。線粒體核裂變需要動力相關蛋白(DRP)1的參與，使線粒體外膜分裂，從而使線粒體管裂變成片段〔16〕。Wang等〔17〕發現在心肌缺血等病理條件下miR-499水平明顯下調，考慮miR-499可能參與調節CMs凋亡。進一步研究發現，鈣調磷酸酶催化亞基(CnA)a 和CnAβ蛋白是miR-499的直接靶標，miR-499通過抑制鈣調磷酸酶介導CRP1脫磷酸化，減少CRP1在線粒體累積和CRP1介導的線粒體裂變程序激活進而抑制CMs凋亡。

還通過分析miR-499的啟動子區域，發現2個典型的P53的轉錄因子結合位點，P53基因可與這兩個轉錄因子結合位點結合，在轉錄水平下調miR-499的表達。同時還發現miR-499轉基因小鼠心臟重塑和心功能明顯改善，如心臟/體重比值，CMs橫截面積，膠原含量明顯下降。而通過antagomir沉默小鼠 miR-499表達加重有害心臟重塑和缺血再灌注損傷，并伴有膠原沉積增加和心肌肥厚、心室擴大及明顯心功能不全。

3.3miR-499與心臟應答Shieh等〔18〕利用轉基因表達不同水平miR-499小鼠模型研究發現，miR-499高水平表達可以劑量依賴的方式導致心肌肥厚和心肌病。高水平miR-499可顯著下調心臟早期應答基因(Egr)1，Egr2和(Fos)的表達，增加壓力負荷誘導心功能障礙的易感性，致小鼠發生自發性心臟收縮功能障礙。同時發現miR-208a基因敲除小鼠miR-499水平下降而Egr1，Egr2 和 Fos水平升高，提示miR-208和miR-499可能共同參與心臟早期應答基因的調控。而早應答基因在心臟對壓力負荷應答基因轉錄層面占重要地位，提示調控miRNA可能是影響高血壓或主動脈瓣疾病等壓力超負荷過大誘發的心血管疾病進展的重要因素。而在Ikeda等〔19〕研究中在人主動脈瓣狹窄時，miR-499水平明顯下降。這種減量調節心臟基因表達的變化可能是一種心臟對壓力負荷重要的生理應答。也可能是因為轉基因小鼠非正常的miR-499下調擾亂了心臟對壓力負荷的正常應答。

4miR-208，miR-499與生物學標志物

Mitchell等〔20〕首次提出miRNA在人類血漿中穩定存在并保有內源性RNA酶活性。使miRNA作為生物學標志物成為可能。

Ji 等〔21〕在用異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌梗死模型中發現血漿miR-208的濃度明顯增加，其出現的時間窗幾乎與肌鈣蛋白一致。而后Corsten 等〔22〕對急性心肌梗死(AMI)、病毒性心肌炎、心舒張功能不全及急性心力衰竭4種心臟病患者的血漿miRNA進行分析，發現與對照組相比，AMI患者血漿miR-208b 和miR-499 顯著升高，分別上升1 600倍和100倍，并與肌鈣蛋白T 和肌酸磷酸激酶(CPK)的升高顯著相關；而在病毒性心肌炎患者中則分別升高30倍和6倍。提示心肌受損時miR-208b 和miR-499釋放入血增加。Wang等〔23〕在對66例胸痛患者及大鼠心肌梗死模型的研究中發現AMI患者血漿miR-1、-133a、-499和miR-208a水平顯著高于健康志愿者、非AMI患者及其他心血管疾病患者。且發現miR-208a具有心肌特異性，幾乎只在心臟表達。在90.9% 的AMI患者和100% 的癥狀發生4 h內的AMI患者血漿中均檢測出miR-208a表達，而非AMI幾乎檢測不到檢測不到miR-208a表達。且通過對特征曲線分析提示miR-208a對AMI診斷具有較高的靈敏性及特異性。

Adachi等〔24〕通過miRNA陣列分析發現miR-499也具有心肌特異性，且miR-499在AMI患者血漿表達顯著增加，而其他心臟疾病患者和健康受試者則處于較低水平，表明miR-499可能是AMI的生物標志物。

另外少數臨床結果顯示〔25〕，在擴張型心肌病的心肌miR-208水平升高，提示miR-208可以預測擴張型心肌病患者心力衰竭和心臟猝死事件的發生，可能與人類的擴張型心肌病中胚胎模式基因的重新表達(例如，上調β-MHC)和心肌膠原積累的增加導致不可逆的心肌損傷有關。

綜上，miR-208和miR-499同屬于MyomiRs家族，在心臟發育、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、心臟電生理傳導、心力衰竭及機體代謝等病理生理過程中發揮重要作用，同時也是很好的生物標志物。而隨著各種miRNA類似物及antagomirs和agomirs的研發，使miRNA的人為調控成為一種新的治療手段。通過調控miR-208和miR-499表達，減少心肌肥厚和心肌纖維化并抑制CMs凋亡，同時促進CMs再生和定向分化，也許會為AMI患者提供一種新的治療策略。但是，目前大部分研究仍處于初期階段，甚至部分結論只是推斷，miR-208和miR-499是否還有其他靶標，部分精細調控機制還有待進一步研究。同時miR-208a對miR-208b和miR-499具有上游調控作用，而miR-499又是miR-208a發揮作用的重要下游效應介質以及其所具有的大量相同的重復序列，它們是否還存在更復雜的調控網絡，還有待探索。

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〔2013-12-27修回〕

(編輯趙慧玲/杜娟)