孕酮對大鼠腦損傷后腦水腫的影響及機制

魏山坡　李翀瑤　司道文

(保定市兒童醫院,河北　保定　071000)

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孕酮對大鼠腦損傷后腦水腫的影響及機制

魏山坡李翀瑤1司道文1

(保定市兒童醫院,河北保定071000)

摘要〔〕目的觀察孕酮對大鼠腦損傷(TBI)后腦水腫和前列腺素(PGE2)表達的影響。方法雄性老年SD大鼠48只隨機分為假手術組、TBI組和孕酮治療組，按照改良的Feeney自由落體損傷裝置制作大鼠腦損傷模型。孕酮治療組傷后1、6 h腹腔注射孕酮16 mg/kg。各組于傷后24 h取材。用免疫組織化學法和免疫印跡法觀察大鼠皮質PGE2的表達水平變化，并測量腦組織含水量。結果與假手術組大鼠相比，TBI組大鼠皮質PGE2表達和腦水腫較假手術組顯著增加(P<0.05)；孕酮治療組與TBI組比較，大鼠皮質PGE2表達和腦水腫明顯減少(P<0.05)。結論孕酮可能通過降低PGE2的表達進而降低腦水腫，發揮TBI保護作用。

關鍵詞〔〕孕酮；腦損傷；腦水腫；前列腺素

1華北理工大學基礎醫學院

第一作者：魏山坡(1977-),男,碩士，副主任醫師，主要從事外科學研究。

腦損傷(TBI)目前尚無有效的治療藥物。近年發現孕酮(PROG)是一種非常具有潛力的腦保護藥物，在不同的模型和種屬以及不同的實驗室，均得到了孕酮對腦損傷安全性和有效性的證據，其潛在治療價值越來越受到認可〔1～7〕。兩項Ⅱ期隨機對照試驗表明，孕酮用于治療臨床患者TBI可明顯減少死亡率〔8,9〕。根據前期研究結果，美國國立衛生研究院贊助的孕酮治療腦外傷的Ⅲ期臨床實驗(ProTECTⅢ:NCT00822900)正在進行，包括17個神經外科中心和預期1 000例患者，期待這些大樣本多中心臨床對照試驗，在不久的將來能對孕酮治療顱腦創傷的療效及安全性作出科學評價〔10〕。目前對孕酮降低腦水腫的機制尚不明確。由于炎癥反應在TBI后的繼發性損傷中占有重要作用，是引起腦水腫的重要因素；而且炎癥反應中環氧化酶(COX)-2的代謝產物前列腺素(PGE2)是重要的炎癥因子。因此，本實驗擬建立老年大鼠TBI模型，探討孕酮降低腦水腫的機制。

1材料和方法

1.1材料健康雄性20月齡SD大鼠48只，體質量300 g(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)。將大鼠隨機分為假手術組、TBI組和孕酮治療組，每組16只，分別用于PGE2免疫組織化學檢測和腦水腫測定。孕酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，兔抗人PGE2多克隆抗體(美國Cayman公司)，免疫組織化學試劑盒 (福州邁新生物)。

1.2動物模型采用Feeney自由落體硬腦膜外撞擊方法建立模型。大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，在矢狀縫后1.5 mm，中線旁2.5 mm處打開一直徑5 mm骨窗，用40 g的擊錘從25 cm處自由墜落沖擊撞桿造成腦損傷。假手術組僅切開頭皮，開同樣大小骨窗而不造成腦挫傷。孕酮治療組傷后1、6 h腹腔注射孕酮16 mg/kg。假手術組和TBI組在相同時相腹腔注射等量生理鹽水。

1.3腦組織含水量測定大鼠24 h斷頭后快速剝離全腦，距傷灶周圍2 mm處取出腦組織，精密電子分析天平測其濕重，然后放入110℃烤箱烘烤24 h，取出后冷卻10 min后稱干重，按下面公式計算：腦含水量(%) =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4免疫組織化學檢測于傷后24 h，對大鼠腦組織取材固定，自視交叉后用恒冷箱切片機連續冠狀切片，片厚10 μm，貼附于載玻片上待用。免疫組化檢測按照試劑盒說明進行操作。PBS代替一抗作陰性對照。陽性細胞為胞質和突起呈棕黃色。采用CMIAS真彩色醫學圖像免疫組化自動分析系統進行陽性細胞計數。切片在400倍光鏡下觀察，隨機取5個視野，計數陽性細胞數，以平均值代表各區計數結果。

1.5Western 印跡檢測傷后24 h，大鼠麻醉后取腦，分離傷灶周圍皮層，置入細胞裂解液中，低溫勻漿，離心15 min，取上清。蛋白定量后加入4倍體積樣本緩沖液，95℃變性5 min。取20 μg樣品在100 g/L SDS-PAGE上電泳后轉至硝酸纖維素膜，以標準蛋白Marker為參照，加入兔抗人PGE2 mAb (1∶400)，4℃過夜，TBST沖洗后，加入二抗，DAB顯色。以β-actin作為內參。蛋白條帶掃描后，應用CMIAS真彩醫學圖像分析系統測定條帶平均光密度值。

1.6統計學處理采用SPSS16.0軟件行方差分析，兩變量間關系分析采用線性相關分析。

2結果

2.1孕酮對大鼠TBI后腦水腫的影響與假手術組大鼠腦組織含水量〔(74.2±1.62)%〕比較，TBI組腦組織含水量明顯增多(83.4±2.48)%(P<0.05)。孕酮治療組腦組織含水量較TBI組顯著減少〔(78.5±2.19)%,P<0.05〕。

2.2孕酮對大鼠TBI后皮層PGE2表達的影響免疫組化顯示，假手術組大鼠皮質偶見PGE2表達(3.4±0.28)%。TBI組傷灶周圍皮質可見大量PGE2陽性細胞的表達〔(46.2±2.76)%，P<0.05〕。孕酮治療組腦損傷周圍皮質PGE2陽性細胞顯著減少(31.5±2.17)%(P<0.05)。進一步Western印跡檢測顯示，假手術組有少量PGE2蛋白表達(2.1±0.19)%。孕酮治療組PGE2條帶光密度值〔(12.8±1.86)%〕與TBI組〔(24.3±2.14)%〕比較，蛋白表達顯著降低(P<0.05)。同時TBI后腦組織含水量與PGE2表達呈正相關(r=0.725,P<0.05)。

3討論

TBI嚴重危害人類健康〔11〕，TBI后炎癥反應在繼發性損傷中具有重要作用。TBI后，通過膠質細胞增生，巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，激活釋放細胞介質和炎性因子，從而誘發和加重血管源性和細胞毒性腦水腫。前期實驗已經證實孕酮可以抑制TBI后炎性因子TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2的表達，減輕炎癥反應過程〔12,13〕。本實驗結果提示TBI后腦水腫的形成可能與PGE2有關；孕酮干預后，可明顯減低腦組織含水量和PGE2，表明孕酮可能通過抑制PGE2的表達進而降低腦水腫，發揮腦保護作用。孕酮通過減輕腦水腫、保護血腦屏障、抑制脂質過氧化反應、減少自由基的產生、減輕鈣超載、抑制興奮性神經遞質的釋放、抑制炎癥反應等多種生物學作用，發揮神經保護作用〔3〕。許多治療腦外傷的藥物在臨床試驗中被否定，或許因為這些藥物僅作用TBI后的單一病理因素，因此不能獲得良好的治療功效；而孕酮能夠阻止創傷后不同階段的病理改變，保護神經元功能和促進DNA修復，具有多效性。而且，孕酮在腦內少突膠質細胞和神經元均可合成孕酮，孕酮還能保護發育的胎兒免遭氧化應激和免疫炎癥的侵害，在神經元-膠質通訊和正常神經元發育中起關鍵性作用；因此可以設想孕酮在成人中樞神經元損傷修復中，許多過程實際重復了胚胎發育的關鍵步驟，這也從另一個角度提示孕酮具有腦保護作用〔1〕。本實驗進一步證實了孕酮的腦保護功能。另外，孕酮有較寬的治療窗，能夠迅速通過血腦屏障，具有使用方便、安全、價格低廉等特點，使得孕酮在治療TBI方面逐漸被認同，有可能成為非常具有潛力的治療TBI的藥物。

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〔2014-05-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：司道文(1975-),男,碩士，副教授，主要從事人體解剖學研究。

基金項目：河北省教育廳科學研究計劃項目(Z2011168);唐山市科學技術研究與發展計劃項目(12140209A-55)；華北理工大學學生創新創業訓練計劃項目(X2015139)

中圖分類號〔〕R742.7〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6017-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.006