miR-378與腫瘤的研究進展

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miR-378與腫瘤的研究進展

鐘思思辛柳燕1鄭永亮2劉愛飛1陳懿建1

(南昌大學醫學院，江西南昌330006)

關鍵詞〔〕miRNAs；miR-378；腫瘤；胃癌；大腸癌；肺癌；乳腺癌；骨髓增生異常綜合征

1贛南醫學院第一附屬醫院血液科2井岡山大學附屬醫院血液科

第一作者：鐘思思(1989-)，女，在讀碩士，主要從事血液系統疾病的研究。

微小RNA是一類長度為20～23個核苷酸大小的內源性非編碼單鏈小RNA〔1〕,可通過直接結合靶mRNA的3′非編碼區(3′-UTRs)并在轉錄后水平對靶基因mRNA進行降解或者抑制其翻譯〔1～4〕。miRNAs參與機體各個生理和病理過程，參與調節人類約30%的編碼基因的表達，在腫瘤發生發展中既可充當癌基因，也可充當抑癌基因的角色〔1～4〕。本文就當前國內外研究miR-378在多種腫瘤〔胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌和骨髓增生異常綜合征(MDS)〕的關聯作一簡要總結。

1MiR-378與胃癌

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在男性的發病率和死亡率均約為女性的2倍。其發病與幽門螺桿菌的慢性感染、腌制鹽腌食品的攝入及吸煙等相關。不同國家及區域之間相差很大，我國是胃癌高發地區〔5〕。

Deng等〔6〕用RT-PCR技術發現miR-378在胃癌細胞株(SGC-7901細胞、AGS細胞 和 MGC-803細胞)和胃癌組織中分別較正常胃上皮細胞(GES-1)和癌旁正常組織顯著低表達，且在低分化的MGC-803細胞較中分化的SGC-7901細胞低表達。并在體外實驗通過分別轉染miR-378模擬物、miR-378抑制物入胃癌細胞株，相比miR-378抑制物組，發現miR-378模擬物組細胞增殖受抑制，細胞停滯在G0/G1期或G2/M期〔6〕。Fei等〔7〕通過在MGC-803細胞分別轉染miR-378模擬物和無關序列，發現miR-378 模擬物組細胞增殖低，細胞凋亡增高，細胞轉移、遷移和侵襲下降。表明miR-378過表達抑制胃癌細胞株增殖、遷移和侵襲，抑制其正常細胞周期，促進細胞凋亡。

Fei等〔7〕通過構建絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)3′-UTR野生型和缺失miR-378結合區域的MAPK1 3′-UTR突變型，螢光素酶報告檢測發現miR-378抑制野生型組的螢光素酶活性，對突變組無影響，提示miR-378直接靶作用于MAPK1。還通過RT-qPCR檢測和Western 印跡(WB)分析發現相對于無關序列和對照組(未處理)，miR-378模擬物組絲裂原活化蛋白激酶1 MAPK1 mRNA和蛋白質水平均下調。通過在MGC-803細胞分別轉染si-MAPK1、陰性對照組，發現相比對照組，si-MAPK1組內MAPK1表達下調，細胞增殖減少，處于G1期高，細胞遷移、侵襲和凋亡增加。提示miR-378靶作用于MAPK1，在胃癌中起抑癌基因作用。Deng等〔6〕用CpGplot軟件發現胃癌組織miR-378啟動子區域存在高甲基化，而胃癌細胞株經去甲基化處理后可使miR-378表達上調，故認為miR-378在胃癌組織和細胞中低表達是因其啟動子區域CpG島高甲基化。進一步用WB發現，在胃癌細胞株中，與轉染對照組相比，轉染不同濃度的miR-378模擬物可抑制血管內皮生長因子(VEGF)的表達，濃度越高，抑制越明顯。綜上提示，在胃癌中，miR-378可通過其啟動子高甲基化負調控VEGF和MAPK1的表達起到抑癌基因作用。Liu等〔8〕用微陣列分析和RT-qPCR發現miR-378在胃癌患者血漿較正常人血漿高表達，而血漿miR-378與患者的臨床分期無關。miR-378在胃癌組織及細胞株中低表達，在血漿中高表達，可能是和胃癌細胞選擇性釋放miR-378進入血液有關〔9,10〕。

2MiR-378與大腸癌(CRC)

CRC是消化系統最常見的惡性腫瘤，據全球癌癥流行病學數據庫(GLOBOCAN)的數據分析，2012年約有140萬新發和70萬死亡的CRC病例。一般情況下，男性發病率比女性高。我國CRC發病率正在上升，可能與其危險因素的增加有關〔5〕。

有研究〔11,12〕用RT-qPCR技術分析miR-378在CRC患者癌組織及其癌旁正常組織、人類CRC細胞株及正常人腸上皮細胞株的表達水平，發現miR-378在CRC癌組織及細胞株較癌旁正常組織、正常腸上皮細胞株表達下調。其結果還發現CRC患者miR-378低表達者腫瘤體積更大，淋巴結轉移陽性率更高，臨床分期更高級，總生存期更短〔11〕。Wang等〔12〕用RT-qPCR發現血清miR-378在37個CRC(20個原發性CRC和17個轉移性CRC)患者較14個正常人血清中高表達，可能是癌癥細胞選擇性釋放miR-378入血液〔9,10〕，然而Kaplan-Meier生存曲線分析顯示血清miR-378的表達水平與生存時間無相關性。

體外實驗等〔11〕通過分別轉染miR-378前體、miR-378阻滯劑和無關序列進入SW620細胞，發現相對于無關序列組，miR-378前體組細胞生長和侵襲受抑制，波形蛋白mRNA及蛋白質水平表達均下調，而miR-378抑制劑組細胞生長加快，侵襲加強，波形蛋白表達上調。提示miR-378在CRC發展中通過靶作用于波形蛋白充當抑癌基因角色。在體內實驗，用分別轉染miR-378前體和對照組的CRC細胞誘導BALB/c 裸鼠體內移植瘤模型，發現與對照組相比，miR-378前體組移植瘤較小。提示miR-378過表達抑制波形蛋白的表達，在體外抑制CRC細胞生長、侵襲；在體內抑制腫瘤的生長。

Wang等〔12〕通過分別轉染miR-378類似物和無關序列入CEC細胞(HT29,HCT116)，發現miR-378類似物組較對照組G0/G1期增多，S期減少。還用目標預測軟件發現細胞分裂周期基因40(CDC40)是miR-378的靶基因，分別轉染CDC40 野生型、CDC40突變型入同一種CRC細胞，發現野生型組螢光素酶活性下降，而突變型組無變化。在CRC細胞株用qRT-PCR技術和WB發現miR-378高表達減少CDC40 mRNA及蛋白質水平。通過補充CDC40可減輕miR-378高表達對細胞周期的抑制作用。且免疫組織化學染色法(IHC)發現CDC40在CRC患者癌組織較其對應癌旁正常組織高表達。用特異siRNAs敲除CDC40基因，可觀察到細胞增殖減少。提示miR-378在CRC高表達抑制CDC40的表達，從而抑制CRC細胞的增殖和發展。由于化療耐藥，許多化療藥物對CRC患者療效不佳。Wang等〔12〕用流式細胞術和原位末端標記法分析發現miR-378高表達加強奧沙利鉑對CRC細胞的誘導凋亡作用，而單獨miR-378并不會促進細胞凋亡，提示miR-378是CRC化療耐藥的關鍵角色。

綜上可知，miR-378過表達通過抑制波形蛋白和CDC40的表達，在體外抑制CRC細胞生長、侵襲，干擾正常細胞周期，在體內抑制腫瘤的生長，并促進CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性。

3MiR-378與肺癌

肺癌是最常見的癌癥，2012年新發180萬病例，占所有癌癥新發病例的13%。是男性癌癥死亡的首要原因，是女性癌癥相關的第二大死因〔5〕。原發性肺癌大部分是非小細胞肺癌(NSCLC)，而NSCLC主要包括肺鱗狀細胞癌(SCC)和肺腺癌〔13〕。

Chen等〔14〕用RT-PCR和Northern bolt 陣列分別發現和驗證了miR-378在有腦轉移的NSCLC患者癌組織(包括肺部及腦部)較無腦轉移的 NSCLC患者肺部癌組織高表達。并在體外實驗通過分別轉染miR-378、anti-miR-378 和 空白載體入A549細胞，用熒光素酶活性檢測發現miR-378組細胞增殖最活躍，為臺盼藍染色得到類似的結果；用transwell 法顯示miR-378組細胞侵襲性最強，且其侵襲能力與miR-378表達量呈正相關；細胞劃痕實驗表明miR-378組細胞遷移最明顯。用WB發現miR-378高表達誘導A549細胞內VEGF、基質金素蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表達上調。體內試驗，發現miR-378組比anti-miR-378組成瘤直徑大；瘤內形成血管數量更大更多，而IHC技術分析移植瘤細胞，發現MMP-2、MMP-9和VEGF在miR-378組腫瘤細胞較anti-miR-378組明顯高表達，故Chen等〔14〕認為miR-378通過關聯VEGF、MMP-2和MMP-9的表達，促進肺癌增殖、遷移和侵襲；在體內促進腫瘤生長及瘤內血管形成。

Skrzypek等〔15〕用熒光素酶活性檢測發現miR-378直接結合血紅素氧合酶-1(HO-1,HMOX1)mRNA下調HMOX1的表達，而質粒轉染發現HMOX1高表達抑制miR-378的表達，提示HMOX1與miR-378存在相互抑制作用。另外，在NCI-H292細胞，熒光素酶活性檢測發現miR-378高表達減少G1期細胞數，增加S和G2/M期細胞，促進細胞增殖和轉移。人工基底膜實驗發現NCI-miR-378組較NCI-HO-1組形成更多的管樣結構。RT-PCR發現HMOX1下調血管生成素-1(Ang-1)和黏蛋白-5AC(MUC5AC)的表達。而miR-378上調Ang-1,Ang-2和MUC5AC 的表達。體內試驗，用NCI-H292-Luc細胞形成移植瘤，發現miR-378組較HMOX1組腫瘤更大。分化群聚指出miR-378組較HMOX1組有更多的毛細血管數。另外，miR-378組移植瘤肺轉移較多。體內的生物體發光圖顯示miR-378組小鼠體內熒光信號更強烈。且發現在miR-378組移植瘤較對照組有更多血管生成和轉移的小型版狀物。故Skrzypek等〔15〕認為miR-378可通過抑制HMOX1的表達，進而促進Ang-1、 Ang-2和MUC5AC 的表達，在體外促進細胞增殖、轉移及血管生成，在體內促進移植瘤形成及血管形成。

4MiR-378與乳腺癌

乳腺癌是全球女性發病率和死亡率最高的癌癥。據最新GLOBOCAN的數據表明，2012年全球約170萬新發乳腺癌病例，占所有女性癌癥患者的25%；占所有女性癌癥死亡的15%。雖然我國該病發病率及死亡率低于全球平均水平，但仍在快速增加〔5〕。另外，從氧化代謝到糖酵解代謝是腫瘤細胞的代謝特征，腫瘤細胞更多依賴糖酵解途徑〔16〕。

Yin等〔17〕用RT-PCR發現miR-378和miR-24在101例乳腺癌患者癌組織中較40例無瘤組織均高表達。miR-378*是miR-378的一種輕微變形形式，Eichner等〔18〕用原位雜交法還發現miR-378*在乳腺導管原位癌(DCIS)、腫瘤或淋巴結轉移組織較正常組織高表達，均表明miR-378*在乳腺癌組織較正常組織高表達。Yin等〔17〕還用單變量邏輯回歸分析發現miR-378和miR-24的高表達與乳腺癌的臨床病理特征無明顯關系。Hatse等〔19〕發現乳腺癌患者血漿miR-378水平與年齡無明顯關系。

Eichner等〔18〕通過掃描miRNAs基因組位點發現miR-378和miR-378*位于過氧化體增殖物激活型受體γ輔激活因子1β(PPARGC1b,PGC 1β)第一個內含子內。miRNA靶點預測(Pictar和TargetScan)算法預測雌激素相關受體γ(ERRγ，ESRRG)和GA結合蛋白轉錄因子α(GABPA)都是miR-378*的靶點。體外實驗，分別轉染erb-b2受體酪氨酸激酶2(ERBB2)基因的特異性siRNA(siE組)和scramble siRNA(siC組)入BT-474細胞，WB發現ERBB2在siE組較siC組低表達，RT-qPCR發現siE組較siC組PPARGC1b和miR-378/miR-378*表達下降，ESRRG和GABPA表達上調。提示ERBB2表達下調減少PPARGC1B和miR-378*的表達，促進ESRRG和GABPA的表達。用質粒分別轉染陰性對照組和miR-378*進BT-474細胞，miR-378*組發現ESRRG和GABPA的 mRNA和蛋白質表達水平均明顯下調。提示乳腺癌細胞中，miR-378*高表達抑制ESRRG和GABPA的表達。另外，研究者們〔18〕還通過RT-qPCR發現miR-378*的表達抑制三羧酸(TCA)循環相關基因的表達，增加糖酵解基因的表達。而且在BT-474細胞分別轉染miR-378*、miR-378*抑制劑，miR-378*組細胞增殖增加，細胞內乳酸含量升高，有氧呼吸減少，而miR-378*抑制劑組正好相反。還有功能研究表明miR-378*參與調節腫瘤細胞的Wargburg效應。提示miR-378*在乳腺癌中，抑制ESRRG和GABPA的表達，抑制細胞有氧呼吸，促進細胞糖酵解途徑，進而促進細胞增殖，同時導致細胞新陳代謝從有氧氧化到糖酵解途徑轉移，最終發揮致癌基因作用。

5MiR-378與MDS

MDS是一類異質性造血干細胞克隆性疾病，以無效造血和高風險向急粒白血病(AML)轉化為特征，可導致外周血細胞減少和遺傳不穩定性〔20〕。MDS有不同亞型，5號染色體長臂缺失MDS〔del(5q)MDS〕是最常見類型之一，也稱5q-綜合征〔21,22〕。研究者們〔23,24〕分別用微陣列分析、RT-PCR發現miR-378在5q-綜合征患者骨髓單核細胞(BM-MNCs)樣本較正常人BM-MNCs樣本明顯低表達。Merkerova等〔25〕還用miRNA芯片分析發現miR-378在來那度胺治療前的5q-綜合征患者外周血單核細胞(PB MNCs)中較正常人PB MNCs明顯低表達，而在經來那度胺治療的5q-綜合征MDS患者PB MNCs中與治療前之間無明顯差異。Venner等〔26〕用RT-qPCR發現miR-378在5q-綜合征和無5q- MDS患者的骨髓樣本CD34+細胞中表達無顯著差異。提示MDS患者miR-378較正常人表達下調，可能起抑癌基因作用，且其表達與5號染色體長臂缺失與否無關。

Merkerova等〔25〕和Venner等〔26〕認為來那度胺是一種沙利度胺類似物，有多效生物學作用，證實其對MDS有多效作用，還發現5q-綜合征較無5q- MDS患者對來那度胺治療顯示更佳臨床反應。Merkerova等〔25〕用RT-qPCR分析共同缺失區域(CDR)內miRNAs的表達，發現只有miR-378和miR-378*存在單倍劑量不足趨勢，且可被來那度胺所誘導，miR-378和miR-378*在5q-綜合征未治療組中低表達，經來那度胺治療后表達明顯上調。Votavova等〔27〕用RT-qPCR研究19個5q-綜合征患者和12個健康人的del(5q)基因劑量效應對不同miRNAs表達的影響，發現miR-378在5q-綜合征患者BM CD34+細胞較正常人表達下調,而在5q-綜合征患者PB粒細胞和T淋巴細胞中不明顯過表達。另外，Merkerova等〔25〕分析CDR內miRNAs的表達與細胞遺傳學反應的相關性，發現僅miR-378和miR-378*的表達水平與骨髓內5號染色體長臂缺失細胞所占百分比之間呈負相關。 Lee等〔28〕證實Suppressor of Fused(SuFu)是miR-378的靶基因，miR-378負調控SuFu的表達。Erdogan等〔24〕發現SuFU是與晚幼紅細胞成熟有很大關聯的核內蛋白。Dostalova等〔23〕發現在5q-綜合征中，miR-378低表達，SuFu高表達，提示miR-378低表達可能是MDS發病原因。可認為miR-378負調控SuFu的表達參與調節MDS的發生發展。

綜上所述，通過對相關組織和外周血清中miR-378的研究，miR-378在胃癌、CRC和MDS中表達下調，擔當抑癌基因角色；在乳腺癌、肺癌中表達上調，擔當促癌基因角色，有望成為癌癥診斷和治療的新靶點。腫瘤的發展是多基因、多步驟共同參與的，當前研究主要集中于miR-378表達水平及相關靶基因的研究，具體網絡通路及機制尚需進一步的研究。

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〔2015-01-09修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：陳懿建(1971-)，男，博士，主任醫師，副教授，碩士生導師，主要從事白血病、血栓與止血的研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160073)

中圖分類號〔〕R735；R733.3〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7253-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.139