阿爾茨海默病生物標志物及其檢測技術研究概況

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阿爾茨海默病生物標志物及其檢測技術研究概況

徐志強1齊鵬楊曉慶2李萬里3

(新鄉醫學院三全學院，河南新鄉453003)

關鍵詞〔〕阿爾茨海默病；生物標志物

1蘇州大學附屬第二醫院2平煤神馬醫療集團總醫院

3新鄉醫學院免疫學教研中心

第一作者：徐志強(1989-)，男，碩士，主要從事神經退行性疾病研究。

阿爾茨海默病(AD)表現為逐漸加重的近期記憶缺失，而遠期記憶則相對不受病情進展的影響。隨著病情的加重，逐漸出現記憶力減退、認知功能障礙、行為異常和社交障礙。AD的病理改變主要累及大腦皮質、海馬、前腦等區域，以淀粉樣血管病及神經元胞質內出現神經原纖維纏結、神經細胞喪失、細胞外淀粉樣肽沉積、神經炎斑或老年斑形成為特征改變。目前，臨床上仍沒有有效的藥物和臨床途徑可治愈AD，早期發現AD并在臨床前期阻斷或延緩AD的病理生理變化，患者的生活質量將會顯著提高。本文就早期AD相關生物標志物及其檢測技術作一綜述。

1蛋白質組學分析技術

1.1二維聚丙烯酰胺凝膠電泳分析二維電泳技術的發明始于1975年的O'Farrel,二維電泳技術將等電聚焦與十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相結合,利用蛋白質的等電點及分子量的差異對混合蛋白樣品進行分離，優于兩者單獨使用分離效果。Li等〔1〕采用二維凝膠電泳和質譜分析發現微囊藻毒素-亮氨酸藍藻派生-精氨酸(MCLR)引起的神經毒性與球蛋白相關，并認為MCLR引起的神經毒性可能與神經退行性疾病相關。Yang等〔2〕采用二維凝膠電泳結合納米高性能液體色譜-電噴霧電離串聯質譜(nano-HPLC-ESI-MS/MS)分析AD患者血清蛋白中肽碎片，并對6個差異表達的蛋白斑點進行鑒定。發現在AD患者血清中跨α-胰蛋白酶抑制劑重鏈p、載脂蛋白A-Ⅳ、肌動蛋白、α-1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶Ⅲ這五種蛋白表達增強。Ciavardelli等〔3〕通過采用二維凝膠電泳和質譜研究三重轉基因小鼠AD模型(3xTg-AD)轉基因小鼠和早老素-1基因敲除〔動物蛋白的表達發生改變但不發展為β淀粉樣蛋白(Aβ)-tau蛋白依賴的病理，也不表現認知能力下降，作為對照〕的小鼠。發現前者參與糖代謝和蛋白質分解代謝的蛋白質的表達上調。其研究結果對突變淀粉樣前體蛋白和磷酸化的tau蛋白的機制闡述有一定的幫助。Chou等〔4〕使用二維差異凝膠電泳和串聯質譜定量測定進行比較蛋白質組學定量分析的方法，對3xTg-AD小鼠的線粒體蛋白質組的變化進行分析，發現線粒體相關蛋白在3xTg-AD和非轉基因小鼠之間大腦皮層23種不同的蛋白質的表達水平差異顯著。

1.2氣相和液相色譜-串聯質譜法(GC-MS和LC-MS/MS)分析液相色譜-質譜聯用技術以液相色譜作為分離系統，質譜作為檢測系統，經純化后的樣品在液相色譜和質譜部分進行分離和離子化，經由檢測器得到質譜圖。液質聯用利用了色譜和質譜優勢的互補，結合了色譜對復雜樣品的高分離能力和質譜的高選擇性，高靈敏度及能夠提供相對分子量和結構信息的優點。它對化合物的結構破壞性很小，因而，適合生物分子和有機分子的分離。與其他分析方法相比，質譜具有更高的靈敏度，對未知分子結構的定性分析也很準確，對標準樣品相對于其他分析方法，要求相對較低。質譜可與高效液相色譜聯用如(HPLC/MS),亦可和氣相聯用如GC/MS。因為質譜和色譜靈敏度基本相同，質譜的進樣系統可以用分離效果很好的色譜來實現，質譜作為色譜的鑒定儀也有分離好，速度快，應用廣等優點。Czech等〔5〕通過采用GC-MS和LC-MS/MS配合單變量和多變量統計分析法對79例AD患者和51名健康對照者腦脊液標本分析 ，AD患者與健康對照組相比共有343種蛋白有表達差異。另外，皮質醇水平升高似乎與AD的發展相關。 AD的嚴重程度與半胱氨酸水平增加和尿苷水平下降相關，且他們是最好的配對組合。Hu等〔6〕使用氣相色譜-質譜法(GC-MS)，對野生型C57BL/6J小鼠和 TASTPM小鼠腦脊液和血漿進行比對， TASTPM小鼠腦脊液中(D-果糖、L-纈氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸)和血漿中(D-葡萄糖、D-半乳糖、亞油酸、花生四烯酸代謝產物、棕櫚酸、D-葡糖酸)發生紊亂。Vanmierlo等〔7〕應用氣相色譜/質譜分析，對植物甾醇與AD組(n=67)和對照組(n=29)的患者血漿和腦脊液中濃度測定。發現AD患者腦脊液中Brassicasterol蛋白顯著降低，因此，Brassicasterol蛋白可能是一個與AD有關的生物標志物。

1.3鳥槍法蛋白組學鳥槍法在基因組測序時,先將DNA打斷,分段測序,然后利用計算機將片段重組在一起,確定生物的基因組序列。鳥槍法在蛋白組研究應用與其相似,先將蛋白混合物降解成肽段,再用質譜進行分析測序,最后計算機根據設定好的運算法則描繪出肽段在蛋白質上的位置圖譜,確定該混合物中的蛋白成分。Shevchenko等〔8〕通過鳥槍法比較Tg2576模型的腦蛋白質組。對1 085種蛋白質進行鑒定和縱向量化。確定了57種年齡依賴性的線粒體蛋白表達減少，其中的一些蛋白與AD的發生相關。Han等〔9〕通過多維質譜為基礎的鳥槍脂類組學進行前瞻性分析，確定超過800種脂類分子水平，發現載脂蛋白E4基因型與認知表現相關。

1.4基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜系統分析法基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜的主要用途有：對生物大分子物質分子量的測定，對蛋白質進行高通量的鑒定，對有機小分子化合物分子量的測定，對寡核苷酸的分析，對基因的單核苷酸多態性的分析等。目前在AD相關蛋白的測定中已經起到了一定的作用。淀粉樣肽的蛋白水解加工在AD的形成過程中起到重要作用，淀粉樣肽的蛋白水解控制大腦Aβ水平。Taki〔10〕通過薄層色譜(TLC)-印跡/基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF)系統(MS)建立了一個新的糖和脂類組學方法，發現AD患者海馬灰質神經節苷脂GD1b GT1B的水平比帕金森病和正常對照組的水平有所降低。他們認為AD是一種受海馬區神經節苷脂代謝性影響的疾病。

2腦脊液(CSF)中AD的生物標志物

2.1tau蛋白神經細胞骨架的主要成分是微管系統，對細胞功能的維持起重要作用，微管由α、β微管蛋白和微管相關蛋白組成。tau 蛋白是一種微管結合蛋白(MAP)，與微管結合并保持微管結構的穩定。微管蛋白與tau蛋白結合作為早期微管組裝核心，從而促進其他微管蛋白在此核心上延伸聚集形成微管。tau 蛋白的微管結合能力主要由絲氨酸、蘇氨酸磷酸化來調節〔11〕。

Sj?gren等〔12〕發現AD患者與年齡匹配的對照受試者相比隨著年齡的增加CSF總tau水平顯著提高。并發現90%以上研究對象的CSF中tau蛋白水平升高的輕度認知障礙(MCI)會轉變為AD。tau蛋白的水平可能是由MCI轉變為AD的標志物。Zetterberg等〔13〕通過對不同的中樞神經系統疾病CSF生物標志物的水平變化分析發現AD患者CSF中總tau蛋白，過磷酸化tau蛋白水平升高，而Aβ1～42的水平降低。Blasko等〔14〕通過評估CSF水平的13個潛在的生物標志物在治療AD、額顳葉癡呆癥、酒精性癡呆、抑郁癥和無任何神經精神疾病的對照組中的作用，發現P-tau181/Aβ42的比值比越高患AD的概率越大。Humpel〔15〕通過研究發現，與對照組相比，AD體內CSF的總tau蛋白和P-tau蛋白增加。并發現tau蛋白磷酸化蘇氨酸231可提高AD和額顳葉癡呆的區分，tau蛋白磷酸化絲氨酸181提高AD和路易體癡呆之間的區分。Mattsson等〔16〕通過對大樣本研究，發現隨著年齡的增加AD患者CSF中Aβ1～42減少，總tau增加，tau蛋白磷酸化增加。

2.2Aβ淀粉樣蛋白斑的主要組成部分是4 kD的Aβ，它代表一個37～43-氨基酸的Aβ種類，Aβ40，即組成主要種類的疏水性肽的非均相混合物。更長的變種Aβ42和Aβ43具有高度聚集傾向。最近證明，Aβ42以及Aβ43是高致病性的，認為會通過觸發一系列的事件導致AD，神經退行性疾病和老年癡呆癥最終導致所謂的淀粉樣蛋白級聯致病。 Aβ是由β-淀粉樣蛋白前體蛋白的水解加工，在Ⅰ型膜蛋白，β-分泌酶和γ-分泌酶的聯合作用產生的〔17〕。Stefani等〔18〕通過調查發現， CSF的生物標記物Aβ1～42、T-tau蛋白、總tau蛋白和tau蛋白磷酸化蘇氨酸181可鑒別AD和血管性癡呆。并且AD患者Aβ1～42的水平非常低。Noguchi等〔19〕通過評估CSF-tau蛋白，CSF-Aβ42和CSF-ptau的進行性核上性麻痹(PSP)和皮質基底節變性(CBD)的生化指標，研究對象為18例PSP，CBD的9例，69例AD和43名對照者。發現在AD患者CSF中Aβ1～42水平顯著下降。CSF中的Aβ1～42和高總tau蛋白的低水平可作為AD的診斷。Gustafson等〔20〕在1992～2002年通過對55名婦女(年齡70～84歲)的縱向調查，結果顯示，Aβ42是預測認知功能下降或癡呆癥的唯一指標。Pesaresi等〔21〕通過對146例散發性AD患者，89例MCI和89例年齡匹配的對照的血漿Aβ1～42水平的比較。發現AD患者有顯著較低的水平。Aβ1～42的減少可能是AD狀態的一個標記，具體而言，從正常狀態或MCI到AD的過渡，而不是發生在疾病的神經變性過程的一個標記。

3血液中AD的生物標志物

3.1淀粉樣前體蛋白和Aβ由淀粉樣前體蛋白的順序裂解所致β-淀粉樣肽的分泌被普遍認為是AD因果關系的基礎。Mayeux等〔22〕通過對530例參與老化和老年癡呆癥患者的流行病學研究，發現血漿Aβ40和Aβ42的水平與年齡相關，在一些患者體內血漿Aβ40和Aβ42的水平較高，但之后都降低了，高血漿水平的Aβ42可能與AD患者的死亡率有關。Pomara等〔23〕通過對34例老年受試者的血漿Aβ40和Aβ42水平與認知功能下降的研究發現，血漿Aβ42水平可能和老年人的認知下降水平有關。van Oijen等〔24〕通過對6 713例參加的癡呆風險研究，隨機抽取了1 756例進行記錄。在隨訪期間(平均8.6年)，對392例癡呆進行了鑒定。調查Aβ的血漿濃度和癡呆癥的風險及其亞型的Cox比例風險模型之間的關聯。發現高血漿濃度的Aβ40，尤其是在血漿Aβ42水平降低時，AD的發生風險增高。Graff-Radford〔25〕等通過對563例認知能力正常的志愿者(平均年齡78歲，62%為女性)使用酶聯免疫吸附試驗，血漿Aβ40和Aβ42水平隨訪2～12(平均3.7)年，進行隊列分析檢測MCI和AD的發病病例。發現在隨訪期間53名受試者發生了MCI或AD，回歸分析結果顯示，血漿Aβ42與Aβ40的比值降低和認知能力的降低顯著相關。

3.2載脂蛋白(Apo)ApoE基因在人類中，存在ε2，ε3和ε4 3種不同的多態性等位基因。ε4等位基因頻率在一般人群中是0.15，但AD患者中是0.4〔26〕。ε4等位基因與AD的發生風險相關聯。在中樞神經系統中ApoE基因編碼的蛋白質和脂質結合對于膽固醇運輸是至關重要的。因此，膽固醇運輸的干擾ApoEε4等位基因攜帶者患AD風險可能增加。

Soares等〔27〕通過對396例MCI患者，112例AD患者和58例健康對照的研究發現，所有具有Apo ε 3/ε4 或 ε4/ε4基因的參與者都表現出明顯的生化特征：低C-反應蛋白水平，高皮質醇，高白細胞介素(IL)13，高ApoB及高γ-干擾素。并認為ApoB可能作為AD和ACI的篩選工具。Song等〔28〕對664例(257例MCI，407例認知正常)平均年齡78歲的參與者隨訪兩年以上，發現血漿中低水平的ApoA1、ApoA2、ApoH和高水平的ApoE和ApoJ，ApoB/ApoA1的高比值。ApoEε4等位基因攜帶者血漿ApoE、ApoC3、ApoH水平較高，但是具有較低水平的ApoB。他們發現具有較高水平的ApoA1、ApoA2、ApoH且ApoB/ApoA1比率升高者將更有可能發生認知能力降低。Doecke等〔29〕通過對一個擁有754例正常個體作為對照和207例AD患者進行研究，發現在AD患者體內皮質醇、胰多肽、胰島素樣生長因子、結合蛋白2、微球蛋白、血管細胞黏附分子1、癌胚抗原、基質金屬蛋白酶2、CD40、巨噬細胞炎性蛋白1α、超氧化物歧氧化物歧化酶和同型半胱氨酸標記物的顯著增加和表皮生長因子受體、ApoE、血紅蛋白、鈣、鋅、IL17、白蛋白下降。

3.3炎性反應因子在AD患者血漿中可以檢測到一些炎癥因子，表明炎癥在AD病理發展過程中有一定作用，隨著小膠質細胞的激活一些細胞趨化因子也隨之產生,進而誘導產生巨球蛋白等，IL又可以誘導一氧化氮合酶，最終以氧化應激損傷神經元。Engelhart等〔30〕對AD患者的研究發現轉化生長因子(TGF)-1和IL-6的血漿水平較高的老年受試者發生癡呆的風險增加。Tan等〔31〕研究，分析外周血細胞釋放細胞因子，較高程度的外周血單核細胞釋放IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α，增加了發生AD的風險。Pratico等〔32〕通過實驗證明，血漿游離體內脂質過氧化的特異性標記物：8，12-iso-iPF(2α)-Ⅵ在體內的脂質過氧化作用，從而增加AD和MCI的發病概率。

4AD相關的候選生物標志物

Wang等〔33〕使用GC-MS技術加上多元統計分析，發現二十二碳六烯酸很有可能作為AD診斷的潛在生物標記物。任進民等〔34〕采用高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)檢測20例AD患者和29例正常對照老年人血漿，發現AD患者血漿中脫氫表雄酮硫酸酯含量降低對診斷老年性癡呆有較高的敏感性和特異性,有一定的臨床應用價值,脫氫表雄酮硫酸酯可作為AD的一項早期診斷指標。 Li等〔35〕對AD 患者和健康老年人血漿進行分析，發現溶血卵磷脂，鞘氨醇和色氨酸可作為診斷AD潛在的生物標志物。Greenberg等〔36〕發現AD患者血漿中3種膽汁酸含量增加，并提示進一步的代謝組學分析可能會發現診斷AD更有價值的生物標記物。Salek等〔37〕對轉基因小鼠TgCRND8 8個大腦區域(大腦皮質、額葉皮層、小腦、海馬、嗅球、腦橋、中腦和紋狀體)進行研究，在觀察的TgCRND8 老鼠內發現：海馬，額葉皮層(異常γ-氨基丁酸)這些區域的相應加載圖分析表明，N-乙酰基-L-天門冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸(海馬例外)、γ-氨基丁酸、膽堿、磷酸膽堿(合并的共振)、磷酸肌酸、肌酸和琥珀酸減少；海馬皮質、額葉皮層(異常γ-氨基丁酸)乳酸(除了在中腦)、天門冬氨酸、甘氨酸及其他氨基酸包括丙氨酸(額葉皮層例外)，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸和水溶性游離脂肪酸增加。這些改變可增強診斷和監測AD。Tukiainen等〔38〕研究了180份血清樣品，其中30%為MCI(神經心理診斷嚴重AD的風險增加)，發現Ω-3 脂肪酸和糖蛋白的改變能增加AD 發病風險，支持炎癥和代謝綜合征并存時能夠形成使認知功能下降的高危環境的觀點。Kaddurah-Daouk等〔39〕對15 例AD 患者CSF進行檢測，發現酪氨酸、色氨酸、嘌呤、生育酚等物質的改變，去甲腎上腺素和其相關的代謝物減少，并分析了酪氨酸、色氨酸、嘌呤、生育酚等物質的代謝路徑。需要進一步對這些生物標記物做大樣本AD人群的代謝組學研究，以期能夠更好地預測臨床前期疾病。

綜上，近年來一些新技術的開發使用，更加促進了蛋白組學的研究，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MS)，高效液相色譜與電感耦合等離子質譜(HPLC-ICP-MS)，液相色譜-紫外光譜-質譜聯用技術(HPLC-UV-MS),熒光差異顯示雙向電泳技術AKTA層析技術表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF),鳥槍法蛋白質組學等對蛋白的分離、定性和定量的檢測，將有助于新的AD生物標記物的發現。

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〔2014-07-12修回〕

(編輯杜娟)

通訊作者：李萬里(1955-)，男，教授，碩士生導師，主要從事神經退行性疾病免疫學機制研究。

中圖分類號〔〕R741〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6317-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.148