柔嫩艾美耳球蟲保護性抗原應用研究進展

周芳玉，王春鳳，楊桂連

(吉林農業大學動物科學技術學院，吉林省動物微生態制劑工程研究中心，長春130118)

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柔嫩艾美耳球蟲保護性抗原應用研究進展

周芳玉，王春鳳，楊桂連*

(吉林農業大學動物科學技術學院，吉林省動物微生態制劑工程研究中心，長春130118)

雞球蟲病是一種重要的雞寄生蟲病，長期以來藥物防治成為抗球蟲病的主要手段，但由于藥物的殘留和耐藥性等問題，使得雞球蟲病的免疫學研究受到廣泛關注。本文對柔嫩艾美耳球蟲不同發育階段重要的免疫保護性抗原研究進行了綜述，旨在為雞球蟲病的免疫防治提供新思路和參考。

雞球蟲病；保護性抗原；免疫防治

雞球蟲病是一種嚴重危害養雞業的寄生蟲病，主要是由艾美耳屬的9種球蟲引起。雞只感染后導致大量腸上皮細胞受損而出血,產生血便,導致體重下降，飼料吸收率降低，嚴重時造成雞只大量死亡，給養雞業帶來不可估量的損失[1]。目前雞球蟲病主要以化學藥物防治為主，但由于存在藥物耐受和殘留問題，其應用受到限制。由于疫苗防治雞球蟲病具有潛在的優越性，越來越多的研究人員將研究目標轉移到了疫苗的研制。通過免疫蛋白組學方法，從基因水平向蛋白質水平的深化，發現更多新的具有較強免疫原性和免疫保護性的球蟲保護性抗原，為球蟲疫苗今后發展的方向。本文對近年來雞球蟲保護性抗原在球蟲病免疫防治中的應用進行綜述，旨在為雞球蟲免疫預防提供參考。

1 柔嫩艾美耳球蟲不同階段的保護性抗原蛋白

相關研究人員采用免疫蛋白組學方法對柔嫩艾美耳球蟲生活史中三個不同階段的可刺激宿主產生抗體的蛋白分別進行了篩選，以期發現新的免疫保護性蛋白[2]。

1.1 未孢子化卵囊中的保護性抗原蛋白 相關研究人員通過免疫蛋白組學在球蟲未孢子化卵囊中發現14種柔嫩艾美耳球蟲已知蛋白，這些蛋白包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、肌動蛋白解聚因子、免疫球蛋白重鏈結合蛋白、丙酮酸激酶、β微管蛋白、柔嫩艾美耳球蟲假定蛋白、子孢子抗原等[2-3]。

1.2 孢子化卵囊中的保護性抗原蛋白 采用蛋白質組學方法在柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊中發現22種柔嫩艾美耳球蟲已知蛋白，包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微線蛋白、微管蛋白、子孢子抗原、表面抗原10、微線蛋白3、柔嫩艾美耳球蟲未知蛋白、烯醇酰基還原酶和轉氫酶等[2-3]。

1.3 柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子中的保護性抗原蛋白 同樣采用蛋白質組學方法在柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子中發現26種柔嫩艾美耳球蟲已知蛋白包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微線蛋白、微管蛋白、表面抗原等[4-5]。

2 柔嫩艾美耳球蟲幾種主要免疫保護性抗原蛋白的應用

通過對柔嫩艾美耳球蟲三個不同階段的免疫保護性抗原蛋白的分析，發現其中幾種蛋白在抗球蟲病方面具有重要的研究價值。主要包括微線蛋白、棒狀蛋白、折光體蛋白、表面抗原、子孢子抗原、菱形蛋白、乳酸脫氫酶等。

2.1 微線蛋白(Microneme Protein,MIC) 頂復門寄生蟲的微線蛋白多數由與高等真核細胞黏附蛋白高度同源的系列調節基序組成，如Ⅰ型凝血酶致敏蛋白重復域(Thrombospondin Type ⅠLike Repeats,TRS)，表皮生長因子重復域(Epidermal Growth Factor Repeats，EGF)，血管性血友病因子A(von Willibrand Factor Type A Domain,vWA)，半乳糖凝集素和蘋果結構域(Apple/PAN domains)，球蟲大部分的MIC蛋白能夠與宿主細胞的葡聚糖特異性結合并建立頂端元件。MIC蛋白表達多變結構域能夠黏附宿主細胞低聚糖表位，在球蟲入侵宿主細胞過程中起到關鍵作用。MIC蛋白多以多價異聚體復合物形式存在，先由內質網合成，然后運送到微線體。每個微線體蛋白復合物有一個“護衛蛋白”能讓微線體復合物與滑動體相互作用[6]。目前MIC蛋白被廣泛用于抗球蟲病研究中且具有一定的免疫保護性作用。張杰等[7]從SD-01株柔嫩艾美耳球蟲的第二代裂殖子總RNA中擴增并克隆了EtMIC2基因，并進一步構建真核表達載體pPIC9-EtMIC2和原核表達載體PET30a-EtMIC2，將陽性重組質粒分別轉染畢赤酵母和大腸桿菌，使用巴斯德畢赤酵母表達系統和大腸桿菌分別表達了EtMIC2蛋白，并對雛雞進行免疫，兩組免疫組的雛雞體重增長量與對照組相比均獲得了較大提高，畢赤酵母和大腸桿菌表達的EtMIC2蛋白質都表現出良好的免疫原性，細胞因子和抗體水平顯著提高。

2.2 頂膜抗原(Apical Membrane Antigen,AMA) AMA最初在瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲中發現，是一個高度保守的抗原蛋白。AMA是由微線體分泌Ⅰ型跨膜蛋白，由胞質區、跨膜區、胞外區組成。E.tenella的基因組中有三個AMA的編碼序列，分別是AMA1 , AMA2, AMA3。AMA1存在于E.tenella子孢子表面，2012年Jiang等[8]人應用表達序列標簽技術(Expressed Sequence Tag,EST) 鑒定了E.terrellaAMA1的cDNA全長，基因全長1608 bp,含有一個開放閱讀框，編碼535個氨基酸，蛋白分子量為58 kDa,實時熒光定量PCR的結果表明，AMAl在子孢子階段的表達水平要高于未孢子化的卵囊、孢子化卵囊和第二代裂殖子，AMA1在E.tenella的入侵和發育中起著重要的作用[9]。Blake等[10]利用基因圖譜法對球蟲中免疫力最強的巨型艾美耳球蟲保護性抗原進行篩選，將兩株具有不同生物學特性的巨型艾美耳球蟲在雞體內進行雜交后的基因組，與柔嫩艾美耳球蟲的基因組進行比對，結果發現與AMA 1具有同源性的抗原可以優先刺激機體產生免疫力，可以優先作為疫苗和藥物開發的研究靶標。

2.3 棒狀蛋白(Rhoptry Protein) 棒狀體是球蟲體內棒狀的細胞器，能夠分泌倆種不同的蛋白一種是與寄生蟲早期入侵相關的蛋白，為棒狀體頸部區域蛋白(Rhoptry Neck Proteins, RONs)，一種是分泌較晚的棒狀體球狀區域蛋白(Rhoptry Proteins, ROPs)，參與帶蟲空泡的形成，改變蟲泡的內環境，并與宿主細胞的信號轉導通路相互作用，輔助蟲體的入侵[11]。ROP蛋白分泌的確切機制還不清楚。有學者提出通過膜結合MIC復合物的胞質尾觸發分泌信號，此復合物能與宿主細胞受體作用。棒狀體頸部區域蛋白(RONs)在入侵早期分泌，對于MJ[12](移動連接)的形成和維持至關重要。而棒狀體球狀區域蛋白(ROPs)分泌的稍晚，蟲泡形成后RONs與AMAI相互作用，引發ROPs的釋放。Aikawa等人經試驗證實MJ是蟲體的重要結構，能夠起到錨定蟲體的作用，繼而產生推力讓寄生蟲向前運動進入寄生泡。由微線體分泌到寄生蟲表面的跨膜蛋白AMA1與RONs作用能夠啟動MJ的形成，寄生蟲通過AMA1錨定在宿主細胞表面，RONs復合物分泌入宿主細胞，然后RON2插入到宿主細胞膜。AMA1和RON蛋白在艾美爾球蟲中是保守的，表明MJ的形成機制可能也是保守的[13]。王曄等成功構建了EtRON2的真核表達質粒pCAGGS-EtRON2,并在真核細胞中獲得表達，為深入研究EtRON2的生物學功能和研制球蟲DNA疫苗奠定了基礎[14]。

2.4 球蟲表面蛋白(Surface Antigen，SAGs) 艾美爾球蟲子孢子和裂殖子表面有一層糖基磷脂酰基醇(GPI)此蛋白可作為表面抗原(Surface Antigen，SAGs)。有研究表明E.tenella的SAGs能夠黏附多種培養細胞，證明這些蛋白參與最初的非特異性黏附階段[15]。最近的研究表明，E.tenella表達多達80種不同的SAG蛋白，并已證實這些蛋白在球蟲生命周期中的調節是有差異的，如第二代裂殖子SAGS表面復合物要比子孢子和第一代裂殖子中多[16]。SAGS能有效的誘導機體產生免疫反應，阻止子孢子入侵細胞。一項研究10種E.tenella子孢子SAGs的試驗表明，其中三種能夠增加雞巨噬細胞中一氧化氮的產量，提高IL-1β，IL-10的轉錄水平，并能降IL-12 IFN-γ轉錄水平[17]。這表明至少有部分的SAGs能夠調節雞的天然免疫和獲得性免疫反應，并刺激細胞免疫，同時有促進炎癥反應，并能在E.tenella感染期間觀察到病理學變化[18-19]。3-lE基因是眾多表面抗原中的一員，Lillehoj等人用重組的E.acervulina 3-1 E蛋白作為抗原能夠引起機體的免疫應答，刺激淋巴細胞增殖，誘導機體產生I FN-γ，減少雞球蟲卵囊的排出量[20]。余東游等構建表達3-1E抗原基因的重組枯草芽孢桿菌作為活載體疫苗對肉雞進行免疫，結果表明該活載體疫苗對肉雞抵抗柔嫩艾美耳球蟲感染具有顯著的生理保護效果[21]。張艷等[22]構建了重組表達載體pGEX-3-1E,并將其轉化入大腸桿菌BL21中，提取質粒經酶切PCR鑒定后，用IPTG誘導表達。表達產物經Western blot檢測顯示，3-1E基因在大腸桿菌中成功表達，為3-1E基因的原核表達提供了依據。

2.5 菱形蛋白(Rhomboid Protein) Rhomboid蛋白自發現以來一直吸引著研究者的注意。研究表明Rhomboid蛋白存在球蟲發育階段的各個時期，而以未孢子化階段轉錄水平最低。作為一類膜內的絲氨酸蛋白酶，它參與著表皮生長因子及表皮生長因子受體信號的轉導。近年來人們在很多頂器門的原蟲體內也發現了Rhomboid蛋白的存在，其中包括柔嫩艾美耳球蟲。經過對弓形蟲和瘧原蟲Rhomboid蛋白的鑒定，發現Rhomboid蛋白水解其底物MIC蛋白是蟲體侵入宿主細胞的關鍵過程[23]。張西臣等通過酵母雙雜交系統研究了倆種蛋白間的相互作用。將含有Rhomboid蛋白、MIC4蛋白以及互作蛋白的酵母細胞AH109破碎后免疫雛雞，從而進行攻蟲試驗，觀察酵母細胞中具有互相作用的兩種蛋白對柔嫩艾美耳球蟲的動物保護性。結果說明，通過體液免疫水平和細胞免疫水平的檢測，各實驗組與對照組相比差異均顯著(P<0.05 )，其中含有兩種互作蛋白的實驗組差異極顯著(P<0.01);攻蟲試驗結果顯示其ACI可以達到168.24;同時試驗結果首次表明酵母細胞也能夠產生一定的免疫保護作用[24]。

2.6 乳酸脫氫酶(LactatedehydrogenaseLDH) 球蟲乳酸脫氫酶(LactatedehydrogenaseLDH)被認為是一種很有潛力的疫苗候選抗原。LDH是一種廣泛分布于微生物、植物和動物細胞內的重要功能酶，是糖酵解途徑的關鍵酶之一。大多數體內寄生蟲的能量來源于無氧糖酵解，LDH是該途徑的終端酶，所以，LDH對于寄生蟲生命活動的正常進行至關重要。目前，國內外關于寄生蟲LDH的研究主要集中在瘧原蟲、弓形蟲等[25]。研究LDH對于促進寄生蟲病診斷抗原和疫苗研究以及新抗蟲藥物的研發有重要的意義。已有研究表明，每種雞球蟲僅有一種LDH，堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲LDH氨基酸序列的同源性為66%～80%，其蛋白在卵囊、子孢子、裂殖體和裂殖子階段的表達水平相當，被認為是一種很有潛力的疫苗候選抗原[26]。王艷歌[27]等構建了重組EtLDH蛋白的真核表達質粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ，并轉染到293T細胞中，通過免疫印跡和間接免疫熒光的方法證實EtLDH基因在真核細胞中成功表達，為進一步研究該蛋白的生物學功能和研制球蟲DNA疫苗奠定了基礎。

2.7 折光體蛋白(FoldingbodyProtein) 球蟲子孢子及第一代裂殖體階段都含有折光體，子孢子侵入宿主細胞后，體內的前后兩個折光體發生融合, 在球蟲裂殖生殖階段,融合體又逐漸發生分裂,但在第一代裂殖生殖之后逐漸消失。因此，有人推測折光體內可能儲存著子孢子通過腸道及細胞內發育前幾小時所需要的營養物質，這可能與蟲體的入侵有關。第一個報道的折光體蛋白為GX3262 (亦稱EtS07 ), 可用多克隆的高免雞血清在E.tenella的cDNA文庫中鑒定出來，用其表達的蛋白免疫雞后，可使盲腸球蟲的病變值下降50%。S07編碼的抗原可作為雞球蟲基因工程疫苗的候選之一。楊智勇[28]通過構建pSIP409-SO7-IL2重組乳酸菌免疫雛雞，測定免疫后各項指標，綜合各項數據結果發現重組菌具有優秀的保護效力。從而證明了S07表達產物能誘導雞產生對E.tenella的保護作用。

3 展望

近年來雞球蟲保護性抗原蛋白的研究發展迅速，逐步有新的具有免疫原性的球蟲抗原被應用，球蟲保護性抗原的研究也為雞球蟲病免疫預防提供了重要的方向。但這些疫苗尚處在試驗研究階段，還有一些瓶頸技術有待解決，例如載體的優化，球蟲保護性抗原基因的篩選，蛋白質如何高效表達，只能誘發對球蟲病的部分保護等。其中主要原因在于部分保護性抗原只是球蟲發育過程中某一階段的抗原，而球蟲生活史復雜，基因組龐大，其保護性抗原又存在種間差異，因此篩選高度保守性共同抗原，研制多價聯合疫苗不失為一種好的方法。另外對表達質粒載體的優化應尋找合適的酶切位點，從而提高質粒的穩定性。研究表明重組蛋白胞外表達可以防止胞內蛋白酶的降解，所以在實驗研究中可以運用表面展示元件使目的蛋白表達在細胞表面從而促進蛋白胞外分泌。相信隨著分子生物學和基因工程技術的發展和球蟲免疫學以及蛋白組學研究的不斷深入，以上問題都會逐步得到解決，球蟲保護性抗原的應用也會更加的廣泛，更多的保護性抗原也會被應用到球蟲免疫當中。

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(編輯：侯向輝)

Progress ofE.tenellaProtective Antigen

ZHOU Fang-yu, WANG Chun-feng, YANG Gui-lian*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,JilinProvincialEngineeringResearchCenterofAnimalProbiotics,Changchun130118,China)

Chicken coccidiosis is an important parasitic disease of chicken. For a long time drug control becomes the main means of against coccidiosis. But due to drug residue and drug resistance issues, making chicken coccidiosis immunology research attracts a wide spread attention.This paper describes the different developmental stages of research ofE.tenella’s important protective antigen and aims to provide new ideas and references for the prevention and immunity of chicken coccidiosis.

coccidiosis；protective antigen；immune prevention

國家863計劃項目(2013AA102806, 2011AA10A215); 國家自然科學基金項目(31272552， 31272541)； 吉林省科技發展計劃項目(20111816)

周芳玉，在讀碩士生，從事動物寄生蟲免疫學研究。

楊桂連。E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn

2015-07-17

A

1002-1280 (2015) 09-0065-05

S852.43