慶大霉素標準品制備中效價測定及原材料選擇的研究

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，郝利華，趙暉

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

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慶大霉素標準品制備中效價測定及原材料選擇的研究

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，郝利華，趙暉*

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

在近期慶大霉素標準品制備過程中遇到兩個問題——雙圈與可靠性測驗不符合規定。通過調整菌懸液濃度、抗生素濃度及上層菌液加入量使雙圈現象得以抑制，以保證測量結果準確可靠。C組分測定結果顯示原料藥與標準品C組分差異較大，容易導致二者劑量反應直線不平行，進而影響可靠性測驗結果。通過更換與標準品C組分更為相近的原料藥使可靠性測驗符合規定。上述改進措施保證了國家標準品賦值的準確性，以期為同業人員效價測定遇到類似問題提供借鑒。

慶大霉素；C組分；雙圈；三劑量法；可靠性測驗

慶大霉素(gentamicin，GM)是由小單孢菌屬(Micromonosporapurpurea)發酵產生的一組結構相近的多組分氨基糖苷類抗生素，它們在結構上是由脫氧鏈霉胺(purposamine)、紫素胺和3-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺縮合成的苷。臨床上使用的慶大霉素主要由Cl、Cla、C2、C2a四個活性成分組成，另外還有其他幾個微量組分，如西索米星(sisomicin)、慶大霉素C2b(也稱為沙加霉素，sagalnicin)、二-氫氧-慶大霉素C2a(Antibiotic JI-20 B，它是Cl、C2和C2a的前導物)等[1-2]。多組分抗生素對檢定菌抑菌作用存在差異，易發生雙圈現象，在獸藥典抗生素微生物檢定法[3]規定范圍內，通過調整菌濃、加菌量、加藥量等措施可使雙圈得以抑制。原料藥與標準品組分差異較大時，易導致二者劑量反應直線不平行，進而影響可靠性測驗結果。通過更換與標準品組分更為相近的原料藥，可使可靠性測驗結果符合規定。近期，在慶大霉素標準品換批制備過程中，遇到了上述兩個問題，通過相應改進措施使問題得以解決。

1 材料與方法

1.1 儀器材料與試藥 抗生素效價測量儀(北京潮聲技術開發公司)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。抗生素I號培養基、pH值7.8的磷酸鹽緩沖液及滅菌水均由中國獸醫藥品監察所中海公司提供；慶大霉素標準品及檢定菌CMCC(B)63202凍干管購于中國食品藥品檢定研究院。慶大霉素標準品批號130326-201015，效價630單位/mg。1.2 雙圈現象的解決方法 在效價測定條件摸索階段，發現菌碟雙圈現象極為嚴重，甚至出現了三圈或四圈的情況。為盡量減小雙圈現象對效價測量的影響，采取了調整菌懸液濃度、抗生素濃度及上層菌液加入量等措施。將優化前后條件總結如表1。

表1 效價測定方法優化前后條件對比表

1.3 可靠性測驗不符合規定的解決方法 《中國獸藥典》二〇一〇年版附錄生物檢定統計法[3]對三劑量法效價測定可靠性測驗的如下4個參數進行了規定：回歸需具有顯著性差異(即P<0.01)，偏離平行、二次曲線及反二次曲線均需不具有顯著性差異(即P>0.05)。然而，在對該批原料藥進行效價賦值時，總是存在偏離平行、二次曲線或反二次曲線中的一項或兩項甚至三項不符合規定的情況。為避免人員個體誤差的干擾，更換檢驗員進行了重復試驗；為避免方法誤差的干擾，采用濁度法代替管碟法進行了測定。然而，無論如何改進，上述問題仍然存在。懷疑可能是由于該批原料藥與標準品的組分差異過大，導致二者具有明顯異質性，從而影響了可靠性測驗結果。因此重新購買了一批原料藥，并根據《中國獸藥典》二〇一〇年版硫酸慶大霉素[3]的方法對這2批原料藥的C組分進行了測定與比較。然后根據藥典方法對這兩批原料藥進行了效價測定與可靠性測驗分析。最終選擇了與標準品C組分更為相近的一批原料藥作為本次標準品制備的原料。

2 結果與分析

2.1 條件改進前后抑菌圈效果對比 提高菌懸液濃度和降低抗生素濃度都可以起到減小抑菌圈直徑的作用。而直徑減小必然導致各層菌圈間距縮小，甚至可能出現菌層生長速度加快外圈將內圈覆蓋的現象，從而起到抑制雙圈的作用。減少上層菌液加入量可以使抑菌圈投射在培養基最上層的環形擴散面積減小。圖1為抗生素抑菌圈球形擴散模式圖，如圖所示，當菌層越薄時，投射在最上層的環形面積越小，抑菌圈越接近于圓形，即雙圈現象越不明顯。改進前后，測得的高劑量抑菌圈直徑均在藥典規定的范圍[3](18～22mm)內，而改進后雙圈現象明顯改善，如圖2～圖3。

圖1 抗生素抑菌圈球形擴散模式圖

圖2 條件改進前慶大霉素抑菌圈效果圖

圖3 條件改進后慶大霉素抑菌圈效果圖

2.2 批原料藥C組分測定及效價測定結果比較 如表2所示，與標準品相比，原料藥1的C1a相差4.8%，C1相差4.3%，C2和C2a加和相差9.0%。也就是說，原料藥1雖然符合藥典關于C組分的規定，但是與標準品均質性差異較大。

與標準品相比，原料藥2的C1a和C1分別僅有2.5%和1.4%的差異，C2和C2a雖然差異為5.5%和4.6%，但二者加和(46.6%)與標準品(47.5%)僅差0.9%，且二者對慶大霉素效價貢獻幾乎相同，因此對其均質性影響不大。

采用藥典方法對2批原料藥進行了效價測定，結果原料藥2可靠性測驗均符合規定，見表3。

3 討論

3.1 雙圈問題的原因與解決措施 如前言所述，慶大霉素為多組分抗生素，不同組分對藥物效價的貢獻有差異，其對檢定菌抑菌作用的差異在菌碟上表現為抑菌圈大小不一致，因而極容易出現雙圈現象。在抑菌圈測量儀上，盡管可以通過調節閾值等參數使儀器盡量讀取同一種抑菌圈的直徑，但仍存在較大測量誤差，這為國家標準品含量賦值的精確性帶來了風險。通過調整菌濃、加菌量、加藥量等措施可使雙圈得以抑制，以保證儀器測定結果準確可靠。

表2 原料藥1、2與標準品C組分差異對比

表3 原料藥1、2效價測定及可靠性測驗結果對比

3.2 組分差異對可靠性測驗結果的影響 二〇一〇年版《中國獸藥典》[3]及《中國藥典》[5]對慶大霉素C組分的規定相同，均為：C1應為25%～50%；C1a應為15%～40%；C2+C2a應為20%～50%。可以看出，藥典標準對每種組分相對含量的規定范圍是相當寬泛的。楊利紅等[4]已研究了慶大霉素4種組分對其效價的貢獻，4種組分效價從1287單位/mg至740單位/mg不等。當原料藥與標準品C組分差異較大時，由于各組分效價貢獻不同，就會導致二者均質性差異大，在效價計算過程中，容易導致二者劑量反應直線不平行，進而導致誤差計算過程中出現偏離平行、二次曲線或反二次曲線具有顯著性差異的情況。而組分差異限值多少時會導致三劑量法可靠性測驗不符合規定？僅據現有數據可知，C2和C2a加和相差9.0%會導致上述問題出現，那么從不具有顯著性差異突變到具有顯著性差異的限值是多少呢？毫無疑問，這一限值對于日后標準品制備過程中原料藥選取是具有指導性意義的。而該限值的獲得要基于進一步的多批次原料藥C組分數據與效價測定數據的統計。

3.3 如何選擇用于制備標準品的原料藥 由于供應緊張，本批標準品制備采取了更換與市面標準品更為相近的原料藥的做法。實際上，更為合理的做法是，對慶大霉素原料藥廠家進行調研與原料收集，將各批原料的C組分數據進行統計，從中選取各組分相對含量位于中值的原料藥，以適應市面上大部分慶大霉素原料與制劑的效價測定。

3.4 管碟法效價測定的影響因素 管碟法作為抗生素效價測定的經典方法，操作步驟復雜，影響因素眾多[6]。試驗菌的活力與濃度、培養基的成分與pH值、緩沖液的成分與pH值、培養環境的無菌程度、培養時間與溫度、效價測量儀的精密度與準確度等等都會對測定結果產生影響。各影響因素還可能存在相互影響，相互作用。在效價測定過程中，需對問題產生的原因認真分析，并采取相應對策，就可消除各影響因素產生的誤差，提高測定結果的準確性與可靠性。

[1] 王岳, 方金瑞. 抗生素[M]. 北京: 科學出版社, 1988: 294-301.[2] Chissell J F, Freeman M, Loran J S,etal. British pharmacopoeial gentamicin sulfate component ratio test by high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr, 1986, 369: 213-217.

[3] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部[M]. 北京： 中國農業出版社， 2010： 附錄121-128， 附錄161-184， 294-296.

[4] 楊利紅，常艷，姚尚辰，等. HPLC法同時測定慶大霉素的組分純度和效價活性[J]. 藥學學報ActaPharmaceuticaSinica，2012, 47(12)：1660-1666.

[5] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典二〇一〇年版二部[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2010:976-977.

[6] 李凡，朱志華，姜鳳麗，等.管碟法測定生物效價影響因素的探討及改進[J].中國獸藥雜志，2008,42(1)：45-48.

(編輯：侯向輝)

農業部決定在食品動物中停止使用洛美沙星等4種獸藥

(中華人民共和國農業部公告第2292號)

為保障動物產品質量安全和公共衛生安全，我部組織開展了部分獸藥的安全性評價工作。經評價，認為洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑可能對養殖業、人體健康造成危害或者存在潛在風險。根據《獸藥管理條例》第六十九條規定，我部決定在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥，撤銷相關獸藥產品批準文號。現將有關事項公告如下。

一、自本公告發布之日起，除用于非食品動物的產品外，停止受理洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑的獸藥產品批準文號的申請。

二、自2015年12月31日起，停止生產用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑，涉及的相關企業的獸藥產品批準文號同時撤銷。2015年12月31日前生產的產品，可以在2016年12月31日前流通使用。

三、自2016年12月31日起，停止經營、使用用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。

農業部

2015年9月1日

摘自中國獸藥信息網

Titer Determination and Selection of Raw Materials for the Preparation of Gentamicin Standard

HAN Ning-ning, XU Yuan, YU Li-na, HAO Li-hua, ZHAO Hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

During the preparation of the standard of gentamicin, two problems were encountered——double circles and the reliability test did not confirm to the requirement. The phenomenon of double circle was suppressed by adjusting the concentration of bacterial suspension, the concentration of antibiotics and the amount of the bacteria, in order to ensure the accuracy and reliability of results. The C component determination results showed that when the difference of C component between the raw material and the standard was obvious, the response lines of two dose were not parallel, and then the reliability test results were affected. The reliability test could confirm to its requirement by replacing the raw material with another batch which C component was more similar to the standard. These improvements ensured the accuracy of the assignment of the national standard, and provided reference for the peers when they meet the same problems during the potency determination.

gentamicin; C components; double circles; method of three doses; reliability test

韓寧寧，從事抗生素檢驗檢測工作。

趙暉。E-mail: 171977364@qq.com

2015-06-29

A

1002-1280 (2015) 09-0037-04

S859.796