高致病性豬繁殖與呼吸綜合征GD強弱毒株感染對豬外周血淋巴細胞亞群的影響

張文利,王海光,孫豐廷，2,劉燦,英聰，2,寧宜寶*

(1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2. 華中農業大學，武漢 430070；3. 中國農業大學，北京 100193)

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高致病性豬繁殖與呼吸綜合征GD強弱毒株感染對豬外周血淋巴細胞亞群的影響

張文利1,王海光1,孫豐廷1，2,劉燦3,英聰1，2,寧宜寶1*

(1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2. 華中農業大學，武漢 430070；3. 中國農業大學，北京 100193)

為了從細胞水平探討PRRSV GD 強毒株和PRRSV弱毒疫苗接種仔豬后對其外周血淋巴細胞亞群的影響，運用血常規技術和流式細胞技術分析了豬體外周血淋巴細胞亞群的動態變化。將30日齡20頭SPF豬分成3組，分別感染HP-PRRSV GD第5代強毒株、GDr180弱毒疫苗株及留作對照。于感染后第0、3、7、10、14、21、28及35天采血進行外周血淋巴細胞亞群測定，分析淋巴細胞亞群的變化。結果表明：HP-PRRSV GD強毒株感染可導致白細胞、淋巴細胞數量、單核細胞、粒細胞、B細胞、Tc細胞、Th細胞、Tm細胞、和γδT細胞數量的下降；而弱毒疫苗GDr180株免疫則表現為白細胞、淋巴細胞、單核細胞、引起粒細胞、B細胞、Tc細胞、Th細胞和Tm細胞的上升，對γδT細胞的影響不大；陰性對照組在整個檢測期間各種細胞基本上保持穩定狀態。從實驗結果可以看出：與HP-PRRSV GD強毒株破壞免疫細胞不同，PRRSV弱毒疫苗 GDr180株免疫接種能刺激豬免疫細胞增殖，給試驗豬提供良好的免疫反應。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征；疫苗株；野毒株；豬；外周血淋巴細胞亞群

高致病型豬繁殖與呼吸綜合征(High Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，HP-PRRS)是由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)引起的一種母豬繁殖障礙和各種日齡(尤其是仔豬)呼吸系統失調的高度接觸性傳染病，感染豬死亡率高[1-2]。在我國，雖然HP-PRRSV弱毒活疫苗已廣泛應用于該病的防控，但是對HP-PRRSV弱毒疫苗的細胞免疫機理的研究鮮有報道，特別是對野毒株與疫苗株同時對比的研究報道更少。HP-PRRSV誘導的免疫系統應答和其他多數豬源病毒性病原不一樣，宿主免疫系統一方面為PRRSV的復制提供場所，另一方面在感染后產生特異性的細胞免疫和體液免疫，為病毒清除發揮重要作用[3]。Pauly T等[4]的研究表明：細胞免疫在抗PRRSV免疫中發揮著重要的作用，試驗豬在人工感染PRRSV后第3～28天CD4+T/CD8+T的比值較感染前顯著下降，細胞因子的反應主要是IFN-γ的反應和少量的IL-2反應[5]。本實驗研究分析了HP-PRRSV GD強毒株和用其人工減弱的GDr180疫苗株感染豬后外周血和淋巴結中淋巴細胞亞群的變化特征，比較了疫苗株和野毒株在動物體內對細胞免疫功能的影響，從而為HP-PRRSV疫苗的細胞免疫機理研究提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物和毒株 SPF豬: 20頭30日齡PSF仔豬，購于北京市SPF豬育種管理中心。HP-PRRSV GD-F5強毒株：由本實驗室分離、鑒定和保存。HP-PRRSV GDr180疫苗株，由本實驗室弱化培育。

1.2 試劑 抗體：SPRD標記小鼠抗豬CD3ε、FITC標記小鼠抗豬CD4、PE標記小鼠抗豬CD8、PE標記小鼠抗豬SWC3a、FITC標記小鼠抗豬CD21等抗體購于北京博蕾德生物科技有限公司(購買于southern biotech，Birmingham，USA)；豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒：購于IDEXX試劑公司。胎牛血清：購于Life Technologies 生物公司。紅細胞裂解液：購于德國RD試劑公司。1%多聚甲醛磷酸緩沖液：1 g多聚甲醛溶于100 mL 0.01 mol/L pH7.4 PBS中，與60 ℃加熱助溶。

2 方法

2.1 動物實驗 將30日齡20頭SPF豬隨機分成三組，強毒組和弱毒組每組7頭，空白對照組每組6頭，各個組之間飼養在不同的動物舍，分開隔離飼養。在30日齡時接種病毒。實驗動物分組和感染情況見表1。試驗期間，每天觀察實驗豬的臨床癥狀，測量直腸溫度，記錄結果。

表1 實驗動物分組和攻毒情況

2.2 豬外周血淋巴細胞亞群數量的測定 將DPI 0、3、7、10、14、21、28、35 d采集的抗凝血混勻后，用血細胞計數儀吸取100 uL計數，獲得外周血白細胞和淋巴細胞總數的絕對值，用于外周血白細胞、淋巴細胞數量的測定和外周血淋巴細胞亞群的分析。

2.3 粒細胞及單核細胞數量的確定 取100 uL抗凝血于2 mL離心管中，加入2 uL PE標記小鼠抗豬SWC3a單克隆抗體，室溫避光作用30 min，加入紅細胞裂解液1mL，輕彈管壁并上下顛倒離心管兩至三次，避光裂解3 min，300 g離心2 min，用含1%胎牛血清的PBS洗滌一次，加入1%的多聚甲醛固定，上機進行細胞檢測。用專門的細胞分析軟件Cell Quest Pro分析，鑒定方法如下：SWC3aSSChigh為粒細胞，SWC3aSSClow為單核細胞。粒細胞和單核細胞數量=血細胞計數儀測定的白細胞總數×流式細胞儀所分析細胞中陽性細胞的百分數。

2.4 B細胞數量的測定 取100 uL抗凝血于2 mL離心管中，加入2 uL FITC標記小鼠抗豬CD21單克隆抗體，室溫避光作用30 min，加入紅細胞裂解液1 mL，輕彈管壁并上下顛倒，離心三次，避光裂解3 min，300 g離心2 min，用含1%胎牛血清的PBS洗滌一次，加入1%的多聚甲醛，上機進行細胞檢測。用專門的細胞分析軟件分析，鑒定方法如下：CD21陽性細胞為B細胞。B細胞絕對數=血細胞計數儀測定的淋巴細胞總數×流式細胞儀所分析的B細胞占淋巴細胞的百分數。

2.5 三色流式細胞術測定豬外周血T淋巴細胞亞群數量 取100 uL抗凝血于2 mL離心管中，加入2 uL SPRD標記小鼠抗豬CD3單克隆抗體，加入2 uL FITC標記小鼠抗豬CD4單克隆抗體，加入2 uL PE標記小鼠抗豬CD8單克隆抗體進行染色，室溫避光作用30 min，加入紅細胞裂解液1 mL，輕彈管壁并上下顛倒離心管兩至三次，避光裂解3 min，300 g離心2 min，用含1%胎牛血清的PBS洗滌一次，加入1%的多聚甲醛，上機進行細胞檢測。用專門的細胞分析軟件分析，鑒定方法如下：CD3+CD4-CD8+為輔助性T(Th)細胞，CD3+CD4+CD8-為殺傷性T(Tc)細胞，CD3+CD4+CD8+為活化/記憶T細胞，CD3+CD4-CD8 low/-為γδT細胞。

各亞群細胞的絕對數=細胞計數儀測定的淋巴細胞×流式細胞儀所分析的各亞群細胞占淋巴細胞的百分含量，T細胞絕對數=Th細胞+Tc細胞+活化/記憶細胞+γδT細胞。

3 結果

3.1 體溫變化 除GD強毒感染的7頭豬在感染后第4天體溫均升至41 ℃，持續3～4 d以外，弱毒疫苗感染的7頭豬和陰性對照6頭豬均無體明顯體溫變化。

3.2 HP-PRRSV GD強弱毒感染后外周血白細胞數量的變化 在HP-PRRSV感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行白細胞數量的測定，空白對照組在1.5×107/mL左右變化 ,結果見圖1。

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圖1 外周血白細胞數量的變化

弱毒組外周血白細胞數量在免疫第三天后迅速上升，然后一直平緩下降至第14天，隨后開始上升。強毒組在攻毒后的白細胞數量一直低于空白對照組，在第14天顯著降低，并一直處于較低的水平。空白對照組外周血白細胞數量在整個過程中相對穩定。結果表明，HP-PRRSV GD強毒株可以導致白細胞數量的減少，而GDr180代疫苗株可以刺激機體產生更多的白細胞。

3.3 HP-PRRSV GD強弱毒感染后外周血淋巴細胞的數量的變化 在HP-PRRSV感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行淋巴細胞數量的測定，空白對照組在1.2×107/mL左右變化，結果如圖2。

圖2 外周血淋巴細胞數量的變化

強毒組在感染的前一個星期處于較高的水平，然后下降，并且一直低于空白對照組直至實驗結束。而弱毒組從免疫后淋巴細胞的數量就開始下降直至第10天，然后快速上升至第21天，開始趨于平穩。空白對照組外周血淋巴細胞數量在整個過程中相對穩定。結果表明，HP-PRRSV弱毒株GDr180可以引起淋巴細胞的上升，而強毒株則引起淋巴細胞數量的下降。

3.4 HP-PRRSV GD強弱毒感染后外周血單核細胞數量的變化 在HP-PRRSV感染后不同天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行單核細胞數量測定，空白對照組在1.5×106/mL左右變化，結果如圖3。

圖3 外周血單核細胞數量的變化

強毒組在攻毒后一直處于較平穩的狀態，在第10天時明顯低于空白組，并且一直保持到整個實驗結束；弱毒組在前10天一直和空白組保持相近的水平，然后一直上升。空白對照組外周血單核細胞數量在整個過程中相對穩定。結果表示，HP-PRRSV弱毒株GDr180可以引起單核細胞的上升，而強毒株可以引起單核細胞數量的下降。

3.5 HP-PRRSV GD強弱毒感染后外周血粒細胞數量的變化 在HP-PRRSV強弱毒感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行粒細胞數量的測定，空白對照組在8×106/mL左右變化，結果如圖4。

圖4 外周血粒細胞數量的變化

弱毒組在免疫后粒細胞數量迅速上升，然后又迅速下降至空白組水平，接著繼續上升，并且一直保持高于空白組的狀態直至實驗結束。強毒組感染后一直處于稍低于空白組的狀態直至實驗結束。空白對照組外周血粒細胞數量在整個過程中相對穩定。結果表明，HP-PRRSV弱毒株GDr180可以引起粒細胞的上升，而強毒株可以引起粒細胞數量的下降。

3.6 HP-PRRSV GD強弱毒感染后外周血B細胞的數量的變化 在HP-PRRSV強弱毒感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行B細胞數量的測定，空白對照組在1.0×106/mL左右變化，結果如圖5。

圖5 外周血B細胞數量的變化

弱毒組在免疫后開始處于比較穩定的水平和空白組無明顯差別，在14 d后迅速上升，并且一直處于較高的水平直至實驗結束。強毒組在攻毒后的14 d一直處于低于比空白組的水平。空白對照組外周血B細胞數量在整個過程中相對穩定。實驗結果表明，HP-PRRSV弱毒株GDr180可以引起B細胞的上升，而強毒株可以引起B細胞數量的下降。

3.7 HP-PRRSV GD強弱毒感染后外周血T細胞亞群數量的變化

3.7.1 外周血Tc細胞數量的變化 在HP-PRRSV GD強弱毒感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行T細胞亞群數量的測定，結果如圖6所示。

弱毒組在免疫后剛開始變化不大，在第10天開始上升直至第21天，隨后變得平穩,并一直高于空白組的水平。強毒組在感染后一直保持與空白組相當的水平，在第10天時低于空白組，并且在實驗結束時都低于空白組。空白對照組外周血Tc細胞數量在整個過程平穩上升。實驗結果表明，HP-PRRSV弱毒株GDr180可以引起Tc細胞的上升，而強毒株可以引起Tc細胞數量的下降。

圖6 外周血Tc細胞數量的變化

3.7.2 外周血Th細胞數量的變化 在HP-PRRSV GD強弱毒感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行Th細胞數量的測定，結果如圖7所示。

弱毒組在免疫后開始處于比較穩定的水平和空白組無明顯差別，在14 d后迅速上升，并且一直處于較高的水平直至實驗結束。強毒組在攻毒后的14 d一直處于低于比空白組的水平，而且隨著時間的延長，更加明顯低于空白組。空白對照組外周血Th細胞數量在整個過程中相對穩定。實驗結果表明，HP-PRRSV弱毒株GDr180可以引起Th細胞的上升，而強毒株可以引起Th細胞數量的下降。

3.7.3 外周血Tm細胞數量的變化 在HP-PRRSV GD強弱毒感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行Tm細胞數量的測定，結果如圖8所示。

圖8 外周血Tm細胞數量的變化

弱毒組在免疫后開始處于比較穩定的水平和空白組無明顯差別，在14 d后迅速上升，并且一直處于較高的水平直至實驗結束。強毒組在攻毒后的14 d一直處于低于比空白組的水平，而且隨著時間的延長，更加明顯低于空白組。空白對照組外周血Tm細胞數量在整個過程中相對穩定。實驗結果表明，HP-PRRSV GDr180弱毒株可以引起Tm細胞的上升，而強毒株可以引起Tm細胞數量的下降。

3.7.4 外周血γδT細胞數量的變化 在HP-PRRSV強弱毒感染后不同的天數內采集實驗豬的外周血(抗凝血)，進行γδT細胞數量的測定，結果如圖9所示。

圖9 外周血γδT細胞數量的變化

弱毒組在免疫后開始處于比較穩定的水平和空白組無明顯差別直至實驗結束。強毒組在攻毒后一直處于低于空白組的水平，在第7天時處于最低點，而且隨著時間的延長，更加明顯低于空白組。空白對照組外周血γδT細胞數量在整個過程中相對穩定。實驗結果表明，PRRSV弱毒株GDr180對γδT細胞的影響不大，而強毒株可以引起γδT細胞數量的下降。

4 討論與小結

T淋巴細胞根據分化抗原和MHC抗原的不同和是否表達CD8和CD4，可劃分為Tc細胞，Th細胞，Tm細胞和γδT細胞。細胞免疫在抵抗病毒感染中發揮著重要的作用，因為Tc細胞可特異性的殺傷靶細胞；Th細胞可促進T細胞的增殖活化，并且與B細胞作用可促進B細胞產生特異性的抗體；Tm細胞可產生免疫記憶，對于下次同種抗原的再次入侵發揮更強大的免疫效應；B細胞介導的體液免疫在抗病毒感染中也發揮著重要作用，因為B細胞的增殖活化可產生中和抗體，與病毒結合使其被清除；白細胞亞群包括白細胞、單核細胞和粒細胞。白細胞是機體防御系統的一個重要組成部分。它通過吞噬和產生抗體等方式來抵御和消滅入侵的病原微生物[6]。

實驗中PRRSV GDF5強毒感染后，豬體內各種T、B淋巴細胞；白細胞、單核細胞和粒細胞等數量降低，并且絕對值都低于空白對照組，說明PRRSV強毒對豬體具有免疫抑制作用。HP-PRRSV GDr180弱毒株免疫后，豬體內的各種淋巴細胞和白細胞在剛開始和空白水平無明顯差別，在免疫后大約2周后出現上升，說明HP-PRRSV GDr180疫苗株不會對仔豬的免疫系統造成抑制，反而會刺激豬體產生更強的免疫保護作用。

大量實驗室研究和臨床數據證明，HP-PRRS體液免疫在疾病預防控制中作用有限，由于PRRSV 的抗體依賴特性的存在，在低抗體水平情況下，抗體不但不能減輕PRRS的疾病程度，反而促進了PRRSV的增殖，加重藍耳病的嚴重性。由此可見，單憑體液免疫不能有效防控豬藍耳病，同時，大量的臨床數據表明，HP-PRRS減毒活疫苗在藍耳病防控中的作用顯著優于滅活疫苗，究其原因，可能是細胞免疫發揮了重要作用。本研究結果表明：與HP-PRRS GD強毒株感染后各種免疫細胞顯著下降不同，HP-PRRS GDr180弱毒疫苗免疫豬 的各種免疫細胞在疫苗免疫兩周后均明顯上升，其上升量甚至明顯高于非免疫正常對照組。由此可見，弱毒活疫苗免疫豬的細胞免疫在疾病控制中發揮了重要作用。

[1] Tian K, Yu X, Zhao T,etal. Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of a typical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J]. PLoS One, 2007, 2(6): e526.

[2] 寧宜寶, 鄭 杰, 張純萍. 我國南方豬高熱病的研究(Ⅱ)——豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離、鑒定和致病性測定[J]. 中國獸藥雜志, 2007, 41(4): 14-18.

[3] Yoon K J, Zimmerman J J, Swenson S L,etal. Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection.[J]. J Vet Diagn Invest, 1995, 7(3): 305-312.

[4] Pauly T, Weiland E, Hirt W,etal. Differentiation between MHC-restricted and non-MHC-restricted porcine cytolytic T lymphocytes[J]. Immunology, 1996, 88(2): 238-246.

[5] Shimizu M, Yamada S, Kawashima K,etal. Changes of lymphocyte subpopulations in pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus [J]. Vet Immunol Immunopathol, 1996, 50(1/2): 19-27.

[6] 寧宜寶. 獸用疫苗學[M]. 中國農業出版社, 2009.

(編輯：李文平)

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《中國獸藥雜志》入編《中文核心期刊要目總覽》

自《中文核心期刊要目總覽》2014年版編委會2015年7月獲悉：依據文獻計量學的原理和方法，經研究人員對相關文獻的檢索、統計和分析，以及學科專家評審，《中國獸藥雜志》入編《中文核心期刊要目總覽》2014年版(即第七版)之畜牧、動物醫學、狩獵、蠶、蜂類的核心期刊。

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Study on Changes of Lymphocyte Subpopulations in Peripheral Blood of the Pigs Inoculated with Highly Pathogenic PRRSV GD Wild and Vaccine Strain

In the study, we used an immunofluorescence assay to investigate changes in lymphocyte subpopulations in peripheral blood of the specific-pathogen-free (SPF) pigs inoculated with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) GD wild and vaccine strains, which was in a cellular way to discuss the effect between the lymphocyte subpopulations in peripheral blood of the SPF pigs and HP-PRRSV GD wild and vaccine type. SPF pigs inoculated with PRRS wild virus showed remarkable decreases in total lymphocytes，white blood cells，monocytes，granulocytes，B cells，Tc cells，Th cells, Tm cells and γδT cells, while SPF pigs inoculated with PRRS vaccine virus increases in total lymphocytes，white blood cells，monocytes，granulocytes，B cells, Tc cells, Th cells，Tm cells after PID 3, and the numbers of all cells remain substantially stable in the negative control group. From these results we can conclude that HP-PRRSV GD wild type can destroy immune cells, while HP-PRRSV GD vaccine type can stimulate immune cell proliferation, which provides a good immune response to the pigs.

highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome; vaccine strain; virulent strain; pig; lymphocyte subpopulations in peripheral blood

張文利，碩士，從事分子病毒學研究。

寧宜寶。E-mail: ningyibao@ivdc.org.cn

2015-08-07

A

1002-1280 (2015) 09-0001-06

S858.28

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 2.HuazhongAgricultureUniversity,Wuhan430070,China; 3.ChinaAgricultureUniversity,Beijing100093,China)

ZHANG Wen-li1, WANG Hai-guang1, SUN Feng-ting1,2, LIU Can3, YING Cong1,2, NING Yi-bao1*