外源病毒檢驗用抗雞傳染性法氏囊病病毒特異性血清的制備與檢定

孫淼，李嶺，李啟紅，李慧姣，李俊平，楊承槐

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

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外源病毒檢驗用抗雞傳染性法氏囊病病毒特異性血清的制備與檢定

孫淼，李嶺，李啟紅，李慧姣，李俊平*，楊承槐*

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

為制備外源病毒檢驗用抗雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)的特異性血清，對300只3～4周齡的SPF雞進行了基礎免疫和加強免疫。最后一次免疫后21d采血并分離血清，血清經混合、分裝、冷凍真空干燥后，對其進行了無菌檢驗、外源病毒檢驗、剩余水分測定、中和效價測定和特異性檢驗。結果表明，本研究制備的抗IBDV特異性血清無菌檢驗、外源病毒檢驗和剩余水分測定均符合《中華人民共和國獸藥典》三部(二〇一〇年版)規定；血清中和效價為1:5747，與IBDV B87株毒種中和指數為104.3，與雞新城疫病毒La Sota株、雞傳染性支氣管炎病毒H120株、雞傳染性支氣管炎病毒H52株、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞痘病毒、禽呼腸孤病毒S1133株的中和指數均不大于10，通過AGP、ELISA、HI等試驗確定血清中不含其他禽源外源病毒抗體。本研究為雞傳染性法氏囊病活疫苗或毒種的外源病毒檢驗提供了具有良好特異性和高效價的中和用血清。

雞傳染性法氏囊病；特異性血清；檢驗

雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一種侵害禽類的急性、高度接觸性、殺淋巴細胞性疾病[1]。免疫接種是控制IBD的主要方法[2]，近年來隨著雞傳染性法氏囊病疫苗的不斷發展，已出現多種不同毒株的IBD活疫苗，如B87株、W2512株、Gt株等。根據《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)[3]規定，IBD活疫苗或毒種必須進行外源病毒檢驗，此項檢驗需用抗IBDV特異性血清對樣品進行中和。因此，抗血清的中和效價和特異性對檢驗起著至關重要的作用。由于市場上缺乏能夠滿足獸用生物制品生產企業檢驗需求的IBD特異性抗血清，因此，本研究優化了免疫條件，利用IBD活疫苗進行基礎免疫，并用IBD滅活疫苗進行加強免疫，制備了1批抗IBDV特異性血清并對其純凈性、中和效價及特異性進行鑒定，為生物制品廠家開展IBD活疫苗或毒種的外源病毒檢驗提供了物質保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒種 IBDV B87株；雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)La Sota株；雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Disease Virus, IBV)H120株、H52株；雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Disease Virus, ILTV)、雞痘病毒(Avian Pox Virus, APV)、禽呼腸孤病毒(Avian Reovirus, ReoV)S1133株均由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應。

1.1.2 SPF雞胚和雞 均購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.1.3 試劑和試劑盒 NDV紅細胞凝集抑制試驗抗原、減蛋綜合征病毒(Egg Drop Syndrome Virus, EDSV)紅細胞凝集抑制試驗抗原、雞馬立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus, MDV)瓊脂凝膠擴散試驗抗原、APV瓊脂凝膠擴散試驗抗原均由中國獸醫藥品監察所制備、提供；禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)H5、H9亞型紅細胞凝集抑制試驗抗原購自哈爾濱維科生物技術開發公司。

ILTV抗體檢測試劑盒購自Biocheck公司；IBV、ReoV、禽網狀內皮組織增生癥病毒(Avian Reticuloendotheliosis Virus, REV)、雞傳染性貧血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus, CIAV)、禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)、禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)(A、B亞群)抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 IBDV B87株繁殖及滅活抗原乳劑的制備均參照《中華人民共和國獸用生物制品規程》(二〇〇〇年版)[4]。

1.2.2 免疫程序 取3～4周齡SPF雞300只，用IBDV B87株活疫苗進行基礎免疫，再用IBDV B87株油乳劑滅活疫苗進行加強免疫3～4次。

1.2.3 血清采集與分離 最后一次免疫后21 d，所有雞心臟采血，分離血清。

1.2.4 組批分裝 將血清混合、分裝，每瓶2 mL，參照《中國獸用生物制品規程》(二〇〇〇年版)進行冷凍真空干燥。

1.2.5 無菌檢驗、外源病毒檢驗和剩余水分測定 按《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)進行。

1.2.6 中和效價測定 將抗雞傳染性法氏囊病病毒特異性血清用滅菌生理鹽水進行2倍系列稀釋，分別與等體積的IBDV B87株病毒液(100ELD50/0.1 mL)混合，室溫(18～24 ℃)作用1 h，經尿囊腔接種10～11日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每胚0.2 mL；同時設病毒對照5枚，每胚接種病毒液0.1 mL。置37 ℃孵育7 d，每日照蛋，記錄雞胚死亡情況，按Reed-Muench法計算中和效價。

1.2.7 特異性檢驗1.2.7.1 交叉中和試驗 將IBDV B87株、NDV La Sota株、IBV H120株、IBV H52株、ILTV、APV、ReoVS1133株毒種做10倍系列稀釋，分別放入2列試管中。第一組取適宜的稀釋度加入等量的抗IBDV特異性血清，另一組加入等量的陰性血清，室溫作用1 h后，經尿囊腔(絨毛尿囊膜)接種9～11日齡SPF雞胚，置37 ℃孵育適宜時間后，計算中和指數。

1.2.7.2 抗體檢測 將抗IBDV特異性血清按照表1中列出的檢驗方法對NDV、APV、ILTV、IBV、ReoV、REV、CIAV、EDSV、MDV、AEV、AIV(H5、H9亞型)和ALV(A、B亞群)抗體進行檢測。

表1 病原抗體及其檢驗方法

注：HI=紅細胞凝集抑制試驗；AGP=瓊脂凝膠擴散試驗；ELISA=酶聯免疫吸附試驗

1.2.8 應用 按照《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)，應用本研究制備的抗IBDV特異性血清，分別與IBDV種毒、IBD活疫苗進行中和試驗和外源病毒檢驗。

1.2.8.1 IBDV B87株種毒中和試驗 將IBDV B87株種毒稀釋至500×103.0ELD50/2 mL(即相當于500羽份IBD活疫苗)，取2 mL與等體積的4倍、8倍、16倍稀釋血清混合，37 ℃中和1 h，分別接種雞胚成纖維細胞和10日齡SPF雞胚，進行中和試驗。

1.2.8.2 3批IBD活疫苗(B87株)外源病毒檢驗 按照《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)，將3批疫苗樣品分別稀釋至500羽份/2 mL，與等體積的抗IBDV特異性血清混合，37 ℃中和1 h，分別接種雞胚成纖維細胞和10日齡SPF雞胚，進行外源病毒檢驗。

2 結果與分析

2.1 無菌檢驗 從凍干的抗IBDV特異性血清中隨機選取5瓶進行無菌檢驗，均無菌生長，符合《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)規定。

2.2 外源病毒檢驗 從凍干的抗IBDV特異性血清中隨機選取3瓶進行外源病毒檢驗，無外源病毒污染，符合《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)規定。

2.3 剩余水分測定 從凍干的抗IBDV特異性血清中隨機選取4瓶進行剩余水分測定，含量分別為1.9%、2.1%、2.0%、2.1%，符合《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)規定。

2.4 中和效價測定 如表2所示，用IBDV B87株進行基礎免疫，再用IBDV B87株油乳劑滅活疫苗進行加強免疫，制備了1批抗IBDV特異性血清共8000 mL。本血清的中和效價為1:5747。

表2 抗IBDV特異性血清中和效價測定結果

2.5 特異性

2.5.1 交叉中和試驗 如表3中所示，將抗IBDV特異性血清與IBDV B87株進行中和試驗，中和指數為104.3；而與NDV La Sota株、IBV H120株、IBV H52株、ILTV、APV、ReoVS1133株的中和指數均不大于10。

表3 抗IBDV特異性血清交叉中和試驗結果

2.5.2 抗體檢測 經HI、AGP、ELISA方法檢測，本研究制備的抗IBDV特異性血清不含NDV抗體、APV抗體、ILTV抗體、IBV抗體、ReoV抗體、REV抗體、CIAV抗體、EDSV抗體、MDV抗體、AEV抗體、AIV(H5、H9亞型)抗體和ALV(A、B亞群)抗體。結果表明，本血清具有良好的特異性。

2.6 應用

2.6.1 IBDV B87株種毒中和試驗 中和試驗結果表明，本研究制備的抗IBDV特異性血清8倍稀釋后能夠完全中和500×103.0ELD50的病毒。

2.6.2 3批IBD活疫苗(B87株)外源病毒檢驗 3批疫苗樣品的外源病毒檢驗結果均為陰性，說明2mL抗IBDV特異性血清能夠完全中和每批次各500羽份的疫苗樣品。

3 討論與小結

按照《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)要求，雞傳染性法氏囊病活疫苗或毒種必須進行外源病毒檢驗。外源病毒檢驗需將IBD活疫苗或毒種稀釋成500羽份/2 mL或5×104.0ELD50/0.1 mL，然后與等量抗血清中和。這要求抗血清應具有良好的特異性和高效價。

章振華等[5]制備了IBDV抗血清并對其進行了檢驗。本實驗室利用多年積累的經驗，優化了免疫方法，最終制備了8000 mL抗血清。按照《中國獸藥典》三部(二〇一〇年版)對血清進行了無菌檢驗、外源病毒檢驗和剩余水分測定，結果均符合規定，確保了血清的純凈性。為了保證抗血清的單特異性，基礎免疫和加強免疫的疫苗均由中國獸醫微生物菌種保藏管理中心保存的IBDV 87株毒種制備，該毒種均嚴格按照《中國獸用生物制品規程》(二〇〇〇年版)進行了鑒定，純凈無細菌、支原體或其他外源病毒污染，有效避免了采用商品化疫苗進行免疫，污染外界病原微生物的可能。本研究在首次免疫前對使用的SPF雞進行了血清抗體篩查，確保無外源病毒感染。所有SPF雞均飼養在位于10000級屏障系統的專用隔離器中，由專人飼喂管理。保證環境潔凈的同時，與SPF雞所接觸的一切，包括飲用水、空氣、飼料、接觸的人員和物品，都必須進行嚴格的微生物控制。除此之外，還建立了完善的消毒及衛生防疫措施，確保在整個實驗過程中不會污染外界病原微生物，影響抗血清的特異性。

為了提高抗血清的中和效價，本研究采用活疫苗進行基礎免疫，然后用滅活疫苗間隔不同時間進行多次加強免疫，促使機體免疫系統持續產生高效價的抗體。章振華等制備的抗血清，僅對NDV、IBV、AIV(H9亞型)和EDSV進行了特異性檢驗，而本研究采用兩種試驗方法對IBDV抗血清進行了特異性檢驗，涵蓋了13種禽源病毒抗體的檢測。交叉中和試驗結果表明，本抗血清與IBDV B87株的中和指數為104.3而與NDV La Sota株、IBV H120株、IBV H52株、ILTV、APV和ReoVS1133株的中和指數均不大于10；經HI、AGP、ELISA方法檢測，NDV抗體、APV抗體、ILTV抗體、IBV抗體、ReoV抗體、REV抗體、CIAV抗體、EDSV抗體、MDV抗體、AEV抗體、AIV(H5、H9亞型)抗體和ALV(A、B亞群)抗體均為陰性，說明本研究制備的IBDV抗血清具有良好的特異性。血清中和效價為1:5747，8倍稀釋后每0.1 mL血清能中和104.7ELD50的IBDV B87株(50羽份)病毒，即1 mL血清能中和500羽份的病毒。應用于外源病毒檢驗時，3批疫苗樣品的病毒含量分別為104.5ELD50/羽份、104.4ELD50/羽份、103.2ELD50/羽份，即1 mL血清能夠中和至少5×106.5ELD50的疫苗樣品。

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].第二版.北京：科學出版社,1997:582-587.

[2] Y.M.Saif.禽病學[M].第12版.北京：中國農業出版社，2012:210-239.

[3] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典三部(二〇一〇年版)[M].北京：中國農業出版社，2011:45-46.

[4] 農業部獸用生物制品規程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規程(二〇〇〇年版)[M].北京：科學出版社，2000:231-233.

[5] 章振華，李林，姜北宇，等.雞傳染性法氏囊病高免血清的制備與檢驗[J].安徽農業科學，2012，40(11):6529-6530.

(編輯：侯向輝)

Preparation and Identification of Specific Antiserum against Infectious Bursal Disease Virus for Exogenous Virus Test

SUN Miao, LI Ling,LI Qi-hong, LI Hui-jiao, LI Jun-ping*, YANG Cheng-huai*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China)

To prepare the specific antiserum against Infectious Bursal Disease Virus (IBDV)for exogenous virus test, 300 SPF chickens with 3～4 weeks old were inoculated with IBD live vaccine and inactivated vaccine. 21 days after the last immunity, serums were collected and mixed thoroughly. After lyophilization, the serum was used for sterility test, exogenous virus test, residual moisture test, neutralization titer determination and specific inspection. The results of sterility test, exogenous virus test and residual moisture test complied with China veterinary pharmacopoeia.Theneutralization titer was 1:5747. The cross neutralization index of the serum induced by IBDV B87 was 104.3, while below 10 induced by other avian viruses. There were no antibodies against other avian disease viruses in this serum, using APG, ELISA and HI test.Antiserum against IBDV was prepared with high specificity and neutralization titer for the identify inspection and exogenous virus test of IBD live vaccines and virus seeds.

infectious bursal disease virus; specific antiserum; test

孫淼，助理研究員，從事動物生物制品檢驗及相關研究。

李俊平。E-mail:lijunping03@163.com；楊承槐。E-mail:ychenghuai@163.com

2015-06-08

A

1002-1280 (2015) 09-0011-04

S852.65