細胞毒性T 淋巴細胞活性檢測方法進展

石秀敏 牛 超 李 敏 金浩范 (吉林大學第一醫院腫瘤中心，長春 130021)

細胞毒性T 淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性的測定是了解機體細胞免疫功能的重要方法。腫瘤免疫治療中使用腫瘤表位分子使特異性的CTL 激活并擴增，達到清除腫瘤細胞的目的［1］，抗病毒多表位DNA 疫苗也在快速發展［2］，這些研究中CTL 的定性和定量檢測非常重要，因此如何更好地檢測CTL 活性成為一個關鍵的問題。近年來，許多新的評估CTL 活性的方法得到發展，本文就此做以綜述。

1 第一代檢測方法

第一代CTL 活性的檢測方法是數十年前發展起來的，主要包括抗原刺激后的增殖實驗以及檢測細胞毒性的51Cr 釋放實驗。這兩種實驗均在整個細胞群體水平評價CTL 的活性，需要預先體外擴增，所以T 細胞活性的檢測依賴于細胞的增殖潛能，實驗結果受體外刺激過程的影響很大，限制了其在檢測體內免疫活性方面的敏感性及應用。

1.1 CTL 增殖實驗 常用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)及3H 胸腺嘧啶核苷摻入法。前者的基本原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性MTT還原為不溶于水的紫色結晶甲瓚(formazan)，甲瓚的生成量與細胞數目和/或細胞活性呈正相關，用二甲亞砜(DMSO)溶解所生成的甲瓚，通過檢測光密度值變化，可間接反映細胞生長及增殖活性。后者的原理是前體T 細胞受到特異性抗原刺激后增殖，具有放射性的3H-TdR 可作為合成DNA 的原料而攝入細胞內，測定細胞內放射性物質的相對數量，就能客觀地反映前體T 細胞對抗原的應答水平。但上述方法實驗周期較長，且不能檢測失能的T 細胞，可能使檢測值偏低。

1.251Cr 釋放實驗 Na251CrO4能進入到增殖的細胞內，與細胞漿蛋白質牢固地結合。當標記了51Cr的細胞死亡后，即可釋放出51Cr。51Cr 輻射γ 射線，通過測定死亡靶細胞釋放到上清中的51Cr，即可計算出效應細胞活性。該方法曾被認為是細胞毒性檢測的“金標準”，但因其敏感性差、標記率低，并存在同位素污染問題，目前已經較少使用。

1.3 Calcein-AM 熒光法 Calcein-AM 是一種可對活細胞進行熒光標記的染色試劑，本身無熒光，穿透細胞膜進入到細胞質后，酯酶會將其水解為綠色熒光物質Calcein(鈣黃綠素)。當效應細胞作用于靶細胞，死亡的靶細胞細胞膜通透性增加，Calcein 就會釋放到細胞培養液中，通過檢測細胞培養液中的熒光，即可獲得效應細胞對靶細胞的殺傷率。不足的是Calcein-AM 在高濃度時可能損害細胞功能，且可發生熒光淬滅，影響檢測結果的準確性。

2 第二代檢測方法

近十年發展起來的第二代體外CTL 活性的檢測方法明顯改善了我們檢測T 細胞活性的能力，這些方法是基于單個細胞水平的檢測，并且提供了細胞的量化結果。

2.1 HMC 四聚體法 對某一抗原而言，其特異性T 細胞的TCR 庫是有限制性的，因此可利用基于TCR 結構特征的方法來檢測某一特定抗原的CTL的克隆的信息［3］。1996 年，Altman 等首次用主要組織相容性抗原復合物(MHC)Ⅰ類分子、抗原肽和熒光染料標記聯接蛋白組成的單體物通過親和素鉸鏈成為四聚體復合物，用來檢測具有特定TCR 的CTL。該法避免了體外培養增殖或同位素殺傷過程，只需合成復合物就可進行定量檢測，檢測到的T細胞數量比常規方法要高10 倍，且可通過流式細胞儀分選將特異性CTL 從淋巴細胞群中分離純化出來。其主要限制因素包括已知的確定的表位、針對各自表位/HLA 等位基因的合適四聚體、四聚體非特異性結合以及不能提供細胞功能方面的信息等。

2.2 檢測細胞因子及細胞毒性顆粒 活化的CTL分泌功能性細胞因子和細胞毒性顆粒，如IL-2、IFNγ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶等，通過檢測細胞因子的分泌情況可反映T 細胞的活性，但是只有產生細胞因子的特異性T 細胞亞型才能被檢測到，并且腫瘤特異性T 細胞所分泌的細胞因子量通常低于病毒特異性的T 細胞，也可能低于ELISPOT 方法的檢測范圍。此外，功能分析對實驗條件的變化很敏感，非特異性細胞因子的分泌可能限制這些方法的靈敏度。

2.2.1 酶聯免疫斑點法(Enzyme-linked immunosorbent spot assay，ELISPOT) CTL 受抗原刺激后一旦分泌功能性細胞因子，就被預包被的抗體直接捕獲，通過局部形成的斑點數目得出分泌細胞因子的T細胞頻數，從而反映抗原特異性CTL 的活性。該方法靈敏度和特異性均很高，且所需T 細胞數量較少，節約臨床樣本，但此法也有一定的局限性，如果T 細胞無功能或分泌其他的細胞因子，就有可能低估CTL 的數量，另外除了CTL、NK 細胞等也可分泌相同的細胞因子，故還需結合細胞表型的分析［4］。Malyguine 等［5］分別對GrB ELISPOT 法、IFN-γ ELISPOT 法和51Cr 釋放法進行了比較，結果顯示三者的相關性較好，并且GrB ELISPOT 法與51Cr 釋放法的反應性非常接近，比IFN-γ ELISPOT 法和四聚體法更快速更直接。

2.2.2 細胞內細胞因子染色法 ELISPOT 法間接地提供分泌某種細胞因子的CTL 數目，而細胞內細胞因子染色法則可以提供更直接、更準確的信息。1993 年，Jung 等采用莫能星(Monesin)等藥物預孵的方法，阻斷胞內高爾基體介導的細胞因子轉運，使其在細胞內蓄積，然后應用兩種免疫熒光抗體分別標記CTL 表面的亞群標志分子和胞內細胞因子，用流式細胞儀進行檢測和分析，即可得到不同T 細胞亞群某一細胞因子的分泌情況。最近 Mitzi Donaldson 等［6］利用8 色細胞內細胞因子染色法，定量測定了臨床前疫苗研究中恒河猴的T 細胞反應。結果顯示，該方法具有很高的重復性，并且在組間、操作者之間及不同時間上的變異很低，是臨床前免疫原性檢測的一個標準方法［7］。

3 第三代檢測方法

第三代CTL 活性的檢測方法提供了更全面的T細胞表型和功能信息。這些分析方法可以多方面提供T 細胞活性的信息，包括T 細胞殺傷效應、增殖以及遷移潛能等。

3.1 Caspase 抗體標記凋亡靶細胞 T 細胞受體識別靶細胞表面的MHC-抗原肽復合物后，CTL 即可釋放穿孔素及粒酶或者激活Fas/FasL 信號通路，靶細胞繼發caspase 瀑布級聯反應，從而發生凋亡，其中caspase-3 是一個重要的凋亡指示蛋白，在凋亡發生的早期就可以被激活。He 等［8］利用細胞示蹤染料DDAO-SE 標記P815、EL4 和T2 淋巴瘤細胞，并用caspase-3 抗體對凋亡細胞染色。結果證明，該方法用于檢測一些人和鼠的抗原特異性CTL 活性是安全、可靠的。Chahroudi 等報道，利用可穿透細胞膜的熒光標記caspase，檢測CTL 誘導的靶細胞caspase 激活，比傳統的51Cr 釋放法更快、更安全、更敏感，能在單個細胞水平檢測靶細胞，并可與其他檢測方法同時進行。CTL 通過釋放穿孔素和粒酶以及激活FasL 和TRAIL 誘導細胞凋亡，但二者在作用時間上不同，Hassin 等［9］通過抗體熒光標記caspase-8 激活和BID 的裂解，解釋了其原因是這兩種機制是同時跳躍式開始的，而FasL 的溶解作用滯后，所以caspase 抗體標記靶細胞是一個很敏感的反映凋亡的方法。

3.2 Annexin V 標記凋亡靶細胞 磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)是一種磷脂，正常情況下分布在細胞膜內側，細胞凋亡時外翻到細胞表面，可與外源性的Annexin V 高親和力結合，從而區分細胞是否發生凋亡。Goldberg 等將效應細胞與靶細胞共孵育后，用PE 結合效應細胞特異性單克隆抗體并標記效應細胞，不能與PE-mAb 結合的細胞即為靶細胞，再用FITC 標記的Annexin V 來檢測細胞凋亡時出現在細胞表面的PS。結果顯示，該方法與51Cr釋放法在檢測細胞毒性方面有明顯相關性。

3.3 PI 或7-AAD 標記死亡靶細胞 評價靶細胞死亡的方法中應用最廣泛的是檢測DNA 嵌入熒光劑的攝取，如PI，可因死亡靶細胞膜通透性增加而進入細胞內，與DNA 嵌合。已經有很多方法聯合熒光染料和DNA 嵌入染料來直接鑒別死亡細胞，特別是Annexin V-FITC/PI 雙染法，已被廣泛用于區別細胞凋亡與死亡。例如，Ozdemir 等［10］將靶細胞和效應細胞用特異性的單克隆抗體染色，用Annexin V 和PI 組合來區分凋亡/死亡細胞。Sun［11］和Yang等［12］也使用Annexin V-FITC/PI 雙染法來區分凋亡/死亡細胞，結果證明這種方法是有效的，毫不遜色于51Cr 釋放法，且更快、更容易操作。

7-AAD 是一種最常用的PI 替代物，也可以穿透死細胞的細胞膜，插入到核酸的雙鏈中，研究證明死亡的靶細胞攝取7-AAD 和PI 的水平幾乎相同。被熒光標記的Annexin V 與靶細胞膜結合，同時加入PI 或7-AAD，可以檢測細胞凋亡，并在單細胞水平上區分細胞凋亡的不同階段。Lecoeur 等［13］也通過標記效應細胞來區分效應細胞和靶細胞。用CFSE來標記效應細胞，在CFSE 陰性的靶細胞群中，用Annexin V-7AAD 來鑒別凋亡細胞和壞死細胞。也有學者用PKH67 標記靶細胞，Annexin V-PE 和7-AAD 評估死亡細胞［14］，結果顯示，流式細胞儀檢測靶細胞死亡率和51Cr 釋放法所得結果之間有明顯相關性。

該方法簡單、可靠，應用廣泛，但是不能區分晚期凋亡細胞和壞死細胞，而且必須要用活細胞來檢測，對細胞的活性要求較高，應該是狀態最好的時候進行檢測。

3.4 溶酶體相關膜糖蛋白(LAMPs)抗體標記效應細胞脫顆粒 細胞毒顆粒，即粒酶和穿孔素是膜包被的溶酶體，CTL 通過胞吐作用將其釋放后介導細胞死亡。包繞細胞毒顆粒的脂質雙層結構包含溶酶體相關膜糖蛋白(Lysosomal-associated membrane glycoproteins，LAMPs)，包括CD107a (LAMP-1)、CD107b (LAMP-2)和CD63 (LAMP-3)。CTL 在適當的刺激下，微管發生移動，將顆粒運送到CTL 的質膜，隨后質膜發生融合，粒酶和穿孔素被釋放到突觸中，繼而發生脫顆粒［15］，導致靶細胞死亡。在脫顆粒過程中，溶酶體膜和細胞膜融合的結果是，溶酶體膜表面的糖蛋白可表達于細胞表面，溶酶體相關膜糖蛋白(LAMPs)抗體與其結合，可標記效應細胞脫顆粒過程。

流式細胞儀檢測CD8+T 細胞上CD107a 和CD107b 的表達作為一種可靠的臨床監測方法，已獲得越來越多的認可。例如，Wang 等［16］人通過流式細胞儀檢測細胞膜上CD107a 的表達，建立了一種可量化評價NK 細胞及CTL 細胞毒性的方法，結果證明該方法可以快速、有效的篩查細胞毒性缺陷相關的疾病，如家族性噬血細胞淋巴組織增生綜合征及其他原發性免疫缺陷繼發的疾病。Yoshikawa等［17］在Glypican-3 (144-152)肽疫苗治療進展期的肝細胞癌患者的I 期臨床試驗中，用Dextramer 和CD107a 抗體對Glypican-3 (144-152)肽特異性CTL細胞進行單個細胞分選，建立了很多Glypican-3(144-152)肽特異性CTL 克隆，并證明了Glypican-3(144-152)肽疫苗誘導的CTL 能高效的識別并殺傷表達Glypican-3 的肝細胞癌細胞。

3.5 其他方法 CTL 被激活后通過表達TRAIL 和Fas-L 與靶細胞表面的相應受體分子結合，啟動信號轉到途徑而誘導凋亡，故CTL 表面TRAIL 及Fas-L 的檢測，可以反映其活化程度和殺傷能力［18，19］;CTL 細胞因子受體及粘附抗原的檢測，可反映其遷移能力［20］;CFSE 稀釋法可反應細胞的增殖能力;CTL 對稀釋后不同濃度抗原的反應，提示TCR 與特異性抗原的親和力;抗原標記的樹突狀細胞在體內的存活也可反映CTL 的活性，等等。

4 展望

CTL 活性檢測在鑒定CTL 優勢表位、評估疫苗效果、預測移植排斥反應等方面有重要的意義，各種檢測CTL 活性的方法已廣泛應用于實驗研究和臨床研究，這些方法各有特點，研究者可根據具體需要進行選擇，其中隨著熒光測定儀器的普及和新的熒光標記物的發現，熒光測定法將有可能取代傳統的方法，而微量和直接測定體內CTL 活性的方法將為細胞免疫研究開辟新路。

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