中醫藥調控膠質細胞源性神經營養因子保護腦缺血再灌注損傷的研究進展

中醫藥調控膠質細胞源性神經營養因子保護腦缺血再灌注損傷的研究進展

任非非劉敬霞1

(寧夏醫科大學，寧夏銀川750004)

關鍵詞〔〕腦缺血再灌注；膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)；中醫藥

中圖分類號〔〕R743〔

基金項目：國家自然科學

通訊作者：劉敬霞(1970-)，女，博士，教授，主要從事中醫藥防治老年病研究。

1寧夏醫科大學中醫學院寧夏醫科大學附屬回醫中醫院

第一作者：任非非(1987-)，男，在讀碩士，主要從事中醫藥防治腦病研究。

缺血性腦血管病(ICVD)是目前威脅人類健康的主要疾病之一，約占全部腦血管病的59.2%～85%〔1〕。缺血性腦損傷包括缺血期原發性損傷和再灌注期繼發性損傷。腦缺血再灌注損傷(CIRI)可發生于多種腦血管疾病中，其病理生理過程是多因素、多環節、多途徑損傷的酶促級聯反應，發病機制復雜〔2〕。膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)是一種作用廣泛的神經營養因子，在中樞和外周神經系統的發育、生長、成熟及損傷修復中發揮重要作用。有研究〔3〕顯示，CIRI本身可誘導缺血周邊區星形膠質細胞表達GDNF，參與內源性神經保護過程，而GDNF也可促進CIRI后腦組織內源性神經干細胞增殖分化，促進神經功能恢復。中醫藥可通過調節CIRI后GDNF的表達發揮抗CIRI、促進神經功能恢復的作用。

1GDNF來源及其作用

GDNF是1993年由Lin等〔4〕最先從培養的大鼠膠質細胞系B49的無血清培養基中經濃縮、分離純化出來的一種能激活鼠胚腹側中腦多巴胺能神經元的神經營養因子〔5〕，與neurturin、persephin、ARTNemin共同組成膠質細胞源性神經營養因子家族。因其一級結構中均含有7個保守的、位置相同的半胱氨酸殘基并具有相同結構，與轉化生長因子β(TGF-β)結構相似，也被認為是TGF-β超家族的一個亞族〔5〕。成熟的GDNF是一種小分子二聚體蛋白質，分子單體由134個氨基酸殘基組成，分子量為15 kD，有兩個N-糖基化位點，有7個保守的半胱氨酸殘基，參與二聚體間二硫鍵的形成。GDNF是一種神經營養因子，通過與由GDNF家族受體α(GFRα)和RET蛋白組合成的受體復合物結合，激活細胞內受體酪氨酸激酶信號傳導通路〔6〕，發揮促進神經元生長及再生修復的作用。

GDNF具有多種生物學活性，不僅能高特異性地促進多巴胺能神經元的存活，減少其凋亡，增加對多巴胺的攝取，而且對外周自主神經系統，特別是運動神經元作用廣泛〔7〕。夏思文等〔8〕認為GDNF可以促進運動神經元生長，且以100 ng/ml較為適宜，當濃度再高，隨著神經元表面受體的飽和，誘向作用減弱。也有研究〔9,10〕顯示，GDNF在促進胚胎發育過程中神經元的存活、軸突的生長、控制神經元的分化及調節突觸傳遞中發揮重要作用。此外，GDNF可減少神經損傷后的神經元變性壞死，也是對該類疾病進行基因治療的候選神經營養因子之一。

2GDNF對CIRI的影響及其機制

2.1CIRI后神經細胞變化及GDNF對其影響CIRI引起的神經損傷包括缺血中心區的神經元壞死和周圍缺血半暗帶區的神經元程序性凋亡兩種形式，且凋亡是腦缺血后神經元死亡的重要形式。這些細胞的損害導致興奮性氨基酸釋放、Ca2+內流、自由基產生、蛋白激酶C(PKC)降低等一系列連鎖反應〔11〕，特別是缺血后不配對電子的持續反應而導致自由基的產生〔12〕，被認為是導致腦功能障礙的主要原因。目前研究〔13〕已證實，當CIRI發生后，在腦組織缺血壞死區域與正常區域之間存在著缺血半暗帶區，該區域腦組織處于低灌注狀態，細胞完整性、代謝和功能仍然存在，如能及時恢復血供或進行藥物干預，組織功能或能恢復，損傷程度減輕。因此，對CIRI后腦組織缺血半暗帶區進行及時有效的神經保護是目前研究熱點。

腦內GDNF的表達對于CIRI后腦內缺血半暗帶區神經元的存活、分化及再生修復至關重要。有研究〔14〕顯示，GDNF能夠通過細胞黏附分子和細胞周期調節蛋白依賴激酶5介導趨化神經干細胞從室管膜下區向嗅球遷移，分化成特定區域的神經元表型，發揮生理作用，這就為CRIR后GNDF促進受損部位神經元再生修復提供可能。胡躍強等〔15〕研究提示CIRI后缺血半暗帶區GDNF表達代償性增高，參與保護CIRI損傷。

另外，有研究〔16〕顯示，GDNF是腦缺血性損傷后內源性神經干細胞再生的影響因素之一，能激活神經干細胞再生機制，促進其再生。龐源廣等〔17〕認為GDNF能促進神經干細胞增殖、分化成星形膠質細胞，發揮改善CIRI的作用。

以上研究均說明，腦缺血后機體可通過促進內源性GDNF的表達，提高神經元抵抗缺血性損傷的能力，促進受損神經元的修復和再生，是機體的一種自我保護性機制。但腦缺血后單純腦組織自身GDNF的代償性增高不足以抵抗損傷性因子的作用〔10〕，而外源性GDNF又由于腦內血腦屏障(BBB)存在導致彌散到腦組織內的含量甚少，不能充分發揮腦保護作用。因此，如何提高機體內源性GDNF的表達對于促進CIRI后神經功能的恢復至關重要。

2.2GDNF保護CIRI的基礎及可能機制

2.2.1GDNF保護CIRI的基礎研究表明，GDNF對神經元的保護及損傷修復是通過其受體復合物介導激活細胞內信號轉導通路，產生相應的效應分子而發揮作用的。GDNF的受體復合物由GFRα和RET蛋白組成〔6〕。GFRα是通過糖基-磷脂酰肌醇(GPI)結合位點直接錨定于細胞膜的外側，其信號不能通過細胞膜。在目前已知的GFRα4種亞型(GFRα1-4)中，GFRα1是GDNF的主要受體。RET蛋白是原癌基因c-Ret編碼產物，其胞外有4個鈣黏附素樣結構(CLD1-4)和1個半胱氨酸富集區(CRD)，胞內有酪氨酸激酶區，胞內和胞外通過跨膜結構區域(TM)相連接，能調節細胞的生長分化〔18〕。GDNF先與GFRα1結合形成GDNF/GFRα1復合二聚體，但因GFRα1錨定于胞外，無跨膜結構，不能傳導信號，故GDNF/GFRα1復合二聚體會促進GFRα1與RET蛋白結合形成GDNF/GFRα1/RET復合物，激活RET蛋白磷酸化，進而激活受體酪氨酸激酶信號轉導通路，發揮生物學效應。也有研究〔19〕顯示，GDNF可以不依賴RET，而與神經細胞間黏附分子(NCAM)、整合素β1結合發揮信號轉導作用。由以上可知，GDNF發揮作用的基礎是與GDNF/GFRα1/RET、NCAM、整合素β1受體等結合，產生相應效應分子發揮作用。

2.2.2GNDF保護CIRI的可能機制研究〔20〕表明，CIRI的機制包括Ca2+超載、自由基增多、興奮性氨基酸毒性、細胞凋亡等，各個因素相互聯系，相互影響。而GDNF保護CIRI的途徑就是通過部分干預以上導致CIRI發生的機制過程進行的。①GDNF抑制細胞凋亡：半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)家族作為特異性的死亡信號轉導分子，被認為是細胞凋亡的執行者。Yu等〔21〕研究顯示，GDNF可抑制腦缺血損傷后Caspase-1、3的表達發揮抑制神經元凋亡的作用。陳貴軍等〔22〕研究提示GDNF可促進NSCs增殖分化并抑制介導神經細胞凋亡的Caspase-3的表達發揮腦保護作用。②GDNF抑制Ca2+超載：當發生腦缺血損傷時，組織內谷氨酸濃度增高，N-乙酰谷氨酸(NMDA)受體被持續激活，激活Ca2+通道，細胞內Ca2+大量內流，造成Ca2+超載，導致神經元壞死或凋亡。Gomes等〔23〕研究發現，GDNF可抑制N-甲基-O天冬氨酸(NMDA)受體活性，抑制Ca2+超載。③GDNF抑制環氧酶(COX)：COX廣泛參與機體損傷后的炎癥反應過程，在CIRI后腦內炎癥反應過程中發揮作用。周鐵柱等〔24〕研究提示GDNF能通過降低COX-2表達發揮神經修復作用。④GDNF抑制星形膠質細胞過度增生：星形膠質細胞在神經系統發育、生長及突觸傳遞等過程中發揮重要作用。其在CIRI發生后反應性增生可減少神經元壞死和凋亡，但與此同時，膠質細胞過度增生會引起膠質化，形成膠質瘢痕影響神經元修復。而GDNF可抑制細胞周期蛋白，組織細胞過度增生。

3中醫藥調控GDNF對CIRI的保護作用

CIRI屬于中醫“中風”病范疇，為本虛標實，上盛下虛之證。中醫藥以其整體調節和綜合治療優勢，在調節內源性GDNF對CIRI的治療中作用顯著，已成為改善CIRI及其機制研究領域的熱點。中藥提取物、中藥復方、針刺等研究日漸增多。

3.1單味中藥及其有效成分對GDNF的調控作用

3.1.1葛根葛根素(Pue)是從中藥葛根中提取的有效成分之一，韓江全等〔25〕提示葛根素(Pue)可以通過提高GDNF表達改善腦缺血損傷，同時也提示改善CIRI后半暗帶區神經細胞功能對于腦缺血神經功能恢復有促進作用。

3.1.2人參人參皂苷(Rb)是從中藥人參中提取出來的主要生物活性成分，其中以Rb1含量最高。徐鵬等〔26〕提示Rb1可通過提高CIRI后缺血周邊區GDNF表達改善神經功能損傷。也有研究〔27〕顯示，Rb1能調節GDNF mRNA表達對缺血腦組織起保護作用。

3.1.3胡黃連胡黃連甲醇是從中藥胡黃連中提取的有效成分。位蘭玲等〔28〕研究顯示，胡黃連甲醇能調節CIRI后GDNF mRNA表達發揮神經保護作用。

3.1.4丹參丹參多酚酸是丹參水溶性成分中重要的有機酸類化合物，王強等〔29〕發現，丹參多酚酸能顯著降低大鼠行為學評分，減小腦梗死體積，能顯著提高腦內GDNF蛋白含量，且以高劑量(30mg/kg)時最明顯，因此推測這可能是中藥丹參發揮腦保護作用的機制之一。

以上資料表明，中藥葛根、人參、胡黃連、丹參幾味藥均可通過上調CIRI后GDNG表達，發揮改善腦損傷作用，這也可能是其發揮作用的機制之一，為臨床治療缺血性腦損傷藥物的選擇提供基礎。

3.2中藥復方對GDNF的調控作用

3.2.1腦絡欣通中藥復方腦絡欣通是治療腦缺血的經驗方，具有益氣活血功效。胡建鵬等〔30〕提示腦絡欣通可通過增強GDNF表達改善CIRI，且作用優于單獨益氣和單獨活血。

3.2.2清熱化瘀方清熱化瘀方由水牛角、丹參、川芎、地龍、石菖蒲等10味中藥組成，具有清熱祛風化痰、活血化瘀通絡的功效。胡躍強等〔31〕研究提示清熱化瘀方能顯著上調GDNF mRNA及其蛋白表達，保護受損神經元。

3.2.3醒腦解毒湯醒腦解毒湯是遼寧省血栓病中西醫結合醫療中心經驗方，由冰片、大黃、水蛭、石菖蒲、黃連、梔子、澤瀉組成，有開竅醒腦，解毒通絡功效。于莉等〔32〕研究發現醒腦解毒湯能有效上調各個時間點GDNFmRNA表達，提示其能通過增加GDNF表達改善腦部損傷。

3.2.4腦脈通腦脈通由中藥大黃、人參、川芎、葛根組成，具有益氣活血、解毒降濁功效。研究〔33〕顯示腦脈通可使MCAO大鼠腦組織GDNF表達增強，并能顯著促進促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)向神經元分化及表達GDNF，發揮腦保護作用。

以上研究顯示，以益氣、活血、化痰、開竅等治則為基礎組成的中藥復方能顯著上調GDNF蛋白的表達，改善缺血性腦損傷，這也切中腦卒中病后正虛邪盛、痰阻竅閉的病機，不僅證實了中藥復方的作用，更為臨床治療疾病提供思路。

3.3針刺及電針對GDNF的調控作用

3.3.1普通針刺劉丹等〔34〕研究提示針刺可通過促進CIRI后GDNF表達發揮神經保護作用，且應盡早介入。

3.3.2電針電針是在針刺腧穴“得氣”后，于針上通以接近人體生物電的微量電流波，以持續刺激穴位，達到防治疾病的一種療法。沈峰等〔35〕認為電針可通過提高CIRI后腦內GDNF表達參與腦保護過程，但未進行各時間點之間的比較，對電針治療的時間窗未研究。徐濤等〔36〕研究說明CIRI能引起腦組織神經營養因子自發性保護性增高，但作用時間較短；而電針能促進GDNF表達。

針刺治療作為中醫治療手段之一，在ICVD治療中有獨特作用。以上資料顯示，針刺可通過上調腦損傷后GDNF表達，改善缺血性腦損傷后神經功能，對損傷后神經功能的恢復起重要作用。

4思考與展望

GDNF作為近年來發現的一種新的、高效能并廣泛存在的神經營養因子，探索其在缺血性腦損傷中的作用及藥物干預機制已成為在缺血性腦損傷治療方面取得突破的重要途徑。雖然GDNF在改善CIRI方面發揮重要作用，但還是存在一些問題：①CIRI自身可誘導內源性GDNF表達代償性增高，但含量較少，作用時間短暫，自我修復能力有限；②外源性GDNF為蛋白質類物質，不能通過消化道直接給藥，給藥方式受限；③GDNF作為大分子親水物質，很難透過血腦屏障(BBB)，即使髓鞘內給藥，其向腦損傷部位的彌散量也有限；④GDNF發揮作用依賴于與其受體特異性結合，而GDNF受體含量有限，不能滿足CIRI后腦組織修復所需，存在受體不足限制。

中醫藥可通過多層次、多靶點來調節內源性GDNF表達，防治腦缺血再灌注損傷，但也有不足之處：①中醫藥對GDNF的調控研究大多停留實驗室研究方面，如何安全有效的用于臨床還需進一步探索；②目前大多研究只單純性地說明中醫藥對GDNF有調控作用，但針對其影響機制研究及中醫理論認識研究較少，研究形式單一；③雖然中藥有效成分、復方、針刺等調控GDNF的研究均有開展，但研究中藥種類較少；中藥復方多是自擬方，而對于成方研究開展較少；針刺治療目前大多為電針療法，針藥結合等多途徑研究有待開展。④雖然實驗室研究顯示中醫藥可通過調控GDNF改善腦缺血損傷，但具體的干預時間窗不統一，對于中醫藥在CIRI后特定階段及時有效干預研究還需深入。因此GDNF作為CIRI后神經干細胞治療的新靶點，對其機制及中醫藥干預研究將成為今后努力的方向。

5參考文獻

1Roger VL，Go AS，Lloyd-Jones DM，etal.Heart disease and stroke statistics-2011 update：a report from the American Heart Association〔J〕.Circulation，2011；123(4)：e18-209.

2范沁林，焦巖，劉國軍，等.大鼠全腦缺血再灌注后HAX-1蛋白與皮質神經元凋亡的關系〔J〕.第三軍醫大學學報，2010;32(6)：584-7.

3Wang J，Yang W，Xie H，etal.Ischemic stroke and repair：current trends in research and tissue engineering treatments〔J〕.Regenerative Med Res，2014；2(1)：3.

4Lin LF，Doherty DH，Lile JD，etal.GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopa minergic neurons〔J〕.Science，1993；260(11)：1130-2.

5Saarma M，Sariola H.Other neurotrophic factors：glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)〔J〕.Microsc Res Tech，1999；45(4-5)：292-302.

6陳琳，戴建國，王中立，等.腦內膠質細胞源性神經營養因子及其受體復合物研究進展〔J〕.中國藥理學通報，2013;29(3)：315-8.

7范瑞芳，沈岳飛.GDNF的神經保護作用的研究進展〔J〕.中國臨床新醫學，2009;2(5)：451-5.

8夏思文，陳世彩，黃益燈，等.不同濃度GDNF對運動神經元誘向生長作用的研究〔J〕.山東大學耳鼻喉眼學報，2014;28(1)：10-3.

9Duarte EP，Curcio M，Canzoniero LM，etal.Neuroprotection by GDNF in the ischemic brain〔J〕.Growth Factors，2012；30(4)：242-57.

10吳娜，董瑞國.膠質細胞源性神經營養因子研究進展〔J〕.徐州醫學院學報，2010;30(7)：487-9.

11Sch?fer MK，Pfeiffer A，Jaeckel M，etal.Regulators of mitochondrial Ca2+homeostasis in cerebral ischemia〔J〕.Cell Tissue Res，2014；357(2)：395-405.

12Kelly PJ，Morrow JD，Ning M，etal.Oxidative stress and matrix metalloproteinase-9 in acute ischemic stroke：the Biomarker Evaluation for Antioxidant Therapies in Stroke(BEAT-Stroke)study〔J〕.Stroke,2008；39(1)：100-4.

13丁利靜，石京山，李菲，等.缺血性腦損傷治療新策略：促進血管新生和神經再生〔J〕.中國新藥與臨床雜志，2013;32(6)：426-32.

14蘇曉慧，孔祥英，林娜，等.缺血性腦損傷后內源性神經干細胞遷移機制及中醫藥的調節作用〔J〕.中國組織工程研究，2012;16(27)：5103-7.

15胡躍強，唐農，劉泰，等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后GDNFmRNA及其蛋白表達的變化〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(20)：3984-6.

16劉罡，吳毅.局灶性腦缺血對內源性神經干細胞激活及遷移的影響〔J〕.中國康復醫學雜志，2009;24(2)：183-6.

17龐源廣，高小青，陳波，等.GDNF基因修飾的神經干細胞移植對大鼠局灶性腦缺血后GFAP表達的影響〔J〕.四川醫學，2013;34(8)：1099-101.

18Forrest SL，Keast JR.Expression of receptors for glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands in sacral spinal cord reveals separate targets of pelvic afferent fibers〔J〕.J Comp Neurol，2008；506(6)：989-1002.

19Sjostrand D，Ibanez CF.Insights into GFRalpha1 regulation of neural cell adhesion molecule(NCAM) function from structure-function analysis of the NCAM/GFRalpha1 receptor complex〔J〕.J Biol Chem，2008；283(20)：13792-8.

20劉青青，郭虹，王少峽，等.腦缺血損傷機制的研究進展〔J〕.中華中醫藥學刊，2012;30(6)：1228-30.

21Yu LY，Saarma M，Arumae U.Death receptors and caspases but not mitochondria are activated in the GDNF-or BDNF-deprived dopa minergic neurons〔J〕.J Neurosci，2008；28(30)：7467-75.

22陳貴軍，高小青，楊朝鮮，等.GDNF基因修飾的神經干細胞抑制腦卒中后大鼠的Caspase-3表達〔J〕.四川醫學，2012;33(9)：1538-41.

23Gomes CA，Simoes PF，Canas PM，etal.GDNF control of the glutamatergic cortico-striatal pathway requires tonic activation of adenosine A receptors〔J〕.J Neurochem，2009；108(5)：1208-19.

24周鐵柱，付霞.膠質細胞源性神經營養因子對局灶性腦缺血大鼠海馬區環氧酶2表達的影響〔J〕.中國醫科大學學報，2009;38(11)：841-2.

25韓江全，李均，李官成，等.葛根素對大鼠缺血側皮質、紋狀體區神經元凋亡及膠質細胞源性神經生長因子的影響〔J〕.第三軍醫大學學報，2009;31(19)：1912-3.

26徐鵬，付曉宇，仲維高.人參皂苷Rb1對大鼠局灶性腦缺血腦組織GDNF表達的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2008;6(8)：937-9.

27李明強，曾照芳，尤萍.人參皂苷Rb1對大鼠腦缺血再灌注神經損傷后的修復作用〔J〕.生物信息學，2011;9(2)：155-6，163.

28位蘭玲，楊繼國，杜芳.胡黃連對缺血再灌注模型大鼠腦內GDNFmRNA表達的影響〔J〕.山東中醫雜志，2009;28(10)：718-9.

29王強，張一，王榕，等.丹參多酚酸鹽對缺血再灌注損傷大鼠腦組織BDNF和GDNF的影響〔J〕.卒中與神經疾病，2013;20(5)：272-4.

30胡建鵬，王鍵，程紅，等.腦絡欣通及其拆方對腦缺血再灌注大鼠腦組織GFAP、bFGF和GDNF蛋白表達的影響〔J〕.中國中醫急癥，2008;17(3)：349-51.

31胡躍強，唐農，劉泰，等.清熱化瘀方對腦缺血再灌注大鼠GDNFmRNA及其蛋白表達的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2011;9(9)：1088-9.

32于莉，臧紅.醒腦解毒湯對急性期缺血性中風大鼠BDNF及GDNFmRNA表達的影響〔J〕.中華中醫藥學刊，2010;28(3)：601-3.

33劉敬霞，李建生，劉軻，等.腦脈通聯合骨髓間充質干細胞移植對腦缺血大鼠神經營養因子表達的影響〔J〕.時珍國醫國藥，2013;24(8)：1986-9.

34劉丹，孫申田，樊爽，等.不同時間針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠GDNF和bFGF蛋白表達的影響〔J〕.現代中西醫結合雜志，2011;20(13)：1588-9.

35沈峰，孫立紅，任婕，等.電針對腦缺血再灌注大鼠海馬GDNF表達的影響〔J〕.湖北中醫雜志，2012;34(4)：25-6.

36徐濤，許能貴，易瑋，等.電針對缺氧缺血性腦病模型大鼠GDNF干預研究〔J〕.中華中醫藥學刊，2013;31(10)：2141-3.

〔2014-02-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)