醬香型白酒釀造體系中酵母菌研究進展

陳美竹，邱樹毅，胡寶東，王 婧，徐 佳，王曉丹，3*

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

醬香型白酒釀造體系中酵母菌研究進展

陳美竹1，3，邱樹毅1，2，胡寶東1，2，王 婧1，2，徐 佳1，2，王曉丹1，2，3*

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

本文綜述了醬香型白酒從制曲、堆積到窖內發酵過程中酵母的多樣性、消長規律、功能及應用的研究，并概述了用于分析醬香型白酒生產中酵母的相關技術。多角度認識醬香型白酒生產過程中的酵母，對揭示醬香型白酒發酵機理及提高白酒質量有一定的借鑒，亦對控制醬香型白酒生產工藝的穩定性和規范性具有指導意義。

酵母；消長規律；多樣性；功能；應用；分析技術

酵母是白酒釀造微生物家族中不可或缺的一類微生物，從醬香型白酒制曲到釀造過程一直可以檢測出，直接關系到產酒率，且能夠代謝產生大量不同的風味物質，對醬香型白酒風格的形成具有重要作用。對醬香型白酒大曲和釀造過程中的酵母進行研究，揭示釀造工藝中酵母消長規律及群落結構，認識微生態環境中酵母作用及其與微生態環境中各種微生物之間的代謝關系，能進一步發揮酵母資源在白酒生產中的作用，提高酵母生物經濟學價值，也為深入研究醬香型白酒發酵機理及呈香機制提供基礎數據和理論依據，并對實際生產具有指導意義。

1 醬香型白酒大曲酵母研究概況

1.1 醬香型白酒大曲酵母消長規律

高溫制曲是醬香型白酒生產的一大特色，曲磚發酵長達40 d，發酵中后期品溫達60℃以上，這為耐高溫微生物提供了良好的生長環境。酵母菌特殊的細胞結構特性能使其對高溫的承受能力有限，因而酵母主要在制曲過程的前期大量繁殖，一般占2%～5%，而后期很少或未檢測到酵母菌[1]。崔福來等[2]利用傳統分析方法考察了醬香型白酒高溫大曲發酵過程中微生物種類及消長規律，發現酵母菌在大曲發酵初期繼續生長繁殖，但隨著曲溫上升而逐漸消失，從而在高溫成品大曲中不能或僅能少量檢出酵母菌。本課題組現階段利用純培養技術對多種醬香高溫成品大曲中酵母的計數結果表明，大曲中的酵母數量較少，約為103CFU/g，酵母菌的數量遠遠少于細菌和霉菌的數量[3]。利用現代分子生態學技術對醬香型白酒大曲中的微生物群落結構的分析亦表明，醬酒大曲中酵母數量約占大曲微生物文庫的2.6%[4]。盡管高溫制曲工藝降低了曲中酵母的數量，但仍然有部分酵母存活或處于休眠狀態，并且成品曲出房后及貯存過程中，能在常溫條件下繼續網絡周圍環境中的酵母，因而能夠在大曲中檢測出少量酵母。利用Biolog-ECO技術來對高溫大曲不同貯存過程中的大曲微生物多樣性變化規律進行研究，表明大曲在貯存過程中曲樣微生物群落結構能夠發生小幅度的變化[5]。

1.2 醬香型白酒大曲酵母多樣性

制曲過程出現的酵母對大曲香味物質及前體形成具有重要作用，而成品曲中的酵母又能夠通過撒曲進入制酒過程進行發酵和產香，因而研究整個制曲過程中的酵母十分必要。目前，利用純培養技術分離醬香型白酒大曲中酵母的研究取得了一定的成果。茅臺酒廠技術中心在2001—2006年對茅臺酒制曲發酵過程中微生物的消長規律做了系統的研究，共分離到了18種酵母，包括假絲酵母（Candidasp.）、絲孢酵母（Trichosporonsp.）、漢遜酵母（Hansenulasp.）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、畢赤酵母（Pichiasp.）、紅酵母（Rhodotorulasp.）、擬內孢霉（Endomycopsissp.）、白地霉（Geotrichum candidum）等酵母[6]。本課題組從醬香大曲中還分離到了Candida kruisii、伯頓畢赤酵母（Pichia burtonii）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、Trichosporon terricola、Trichosporon dermatis等酵母[7-8]。此外，其他研究還從醬香大曲中分離到了卡斯特假絲酵母（Candida casterllani）、Zygosaccaromyces cidrci、Hyphichia burtoniia、Pichia galeiformis、費比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）、拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichomonascus ciferrii等酵母[1，4，9-10]。引入現代分子生態技術來研究醬香大曲中的酵母，發現曲中還存在Candida silvae、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）等酵母，而扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）是醬香大曲中的優勢酵母，而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在大曲中處于弱勢地位，對醬香型大曲中酵母結構組成進行了補充[10]。隨著技術的發展和研究的深入，大曲中酵母多樣性和消長情況必將更加完善，為醬香大曲的科學生產和管理提供理論依據。

2 醬香型白酒堆積過程酵母的研究

2.1 醬香型白酒堆積過程酵母消長規律

醬香型白酒高溫制曲工藝限制了大曲中酵母的數量，無法為窖內發酵過程提供充足的酵母資源，因而需要在堆積過程實現酵母的富集，并在微生物和酶的作用下為酵母提供足夠可供窖內發酵的糖、香味物質前體等原料。了解堆積過程中酵母的變化規律和微觀組成對認識堆積發酵機理具有重要作用。目前對堆積過程中酵母的研究已經取得了一定的成果。課題組對醬香型白酒整個生產周期不同堆積過程中酵母數量變化進行了系統的研究，表明酵母在堆積后數量明顯增加，增加幅度可達到1～3個數量級，但增加幅度因堆積輪次和車間而異[3]。貴州省輕工業科學研究所對堆積過程中酒醅各層酵母隨堆積時間而發生的變化做了系統的研究，表明隨著發酵時間的推進，受堆子中各位點的溫度、酸度和氧濃度的差異的影響，發酵酒醅堆各層面、各部位的酵母菌總量呈現明顯差異，其中以堆上和堆中酵母數量增長最快[11]。四川省農業科學院研究所對郎酒堆積過程中酵母變化進行研究，表明堆上、堆中和堆心中的酵母數量均在第2天時達到高峰，此后呈下降趨勢；整個過程中，酵母菌數量增幅能達到5個數量級；堆積終了時酵母是堆積酒醅中主要的微生物，且表層酵母菌占總數的73%以上[12]。可見堆積過程調控了酒醅中酵母的數量，為后續發酵提供了足夠的動力。

2.2 醬香型白酒堆積酒醅中酵母多樣性

目前，對醬香白酒堆積酒醅中酵母結構的研究已經到了一定階段。通過對茅臺酒廠堆積酒醅進行研究，已經分離到了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、克魯斯假絲酵母（Candida krusei）、漢遜酵母（Hansenulasp.）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、絲孢酵母（Trichosporon sp.）、假絲酵母（Candidasp.）、白地霉（Geotrichum candidum）、意大利酵母（Saccharomyces italicus）、地生酵母（Saccharomyces telluris）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、間型假絲酵母（Candida intermedia）、卡爾斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、球擬酵母（Torulopsis sp.）、擲孢酵母（Sporobolomycessp.）等[11，13-14]。其他研究從醬香型白酒堆積酒醅中分離到的酵母有Pichia galeiformis、拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、費比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Candida apicola、白地霉（Galactomyces geotrichum）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、Kazachstania exigua、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、Carl Bloomsbury yeast、Candida krusei、Trichosporon yeast、Throw toruloides、Hyphichia Burtoniiai等酵母[9，11]。這些研究不斷對醬香型白酒堆積酒醅中酵母組成進行補充，并且隨著研究的深入，對其認識將更加全面。

2.3 醬香型白酒堆積酒醅中酵母的來源

堆積過程能夠富集大量酵母，但是這些酵母是來自于大曲還是環境。目前，學術界和白酒行業對酒醅中酵母的來源還存在爭議，研究也在不斷進行。珍酒酒廠對堆積過程酵母變化進行研究，表明隨著堆積時間的推進，酵母種類持續增加[15]。茅臺酒廠技術中心從制酒堆積和發酵過程中分離到了85種微生物，包括28種酵母，其中有至少7種酵母源于茅臺大曲，其他微生物主要來源于空氣、場地和生產用原輔料[6]。通過對某醬香型白酒廠整個生產周期中大曲、空氣、出甑酒醅、攤涼后未加曲酒醅、加曲后酒醅等樣品中的酵母分別進行檢測，表明曲粉與空氣中的酵母進入了酒醅中，但是對酒醅中酵母的貢獻小于攤涼地面，明確了攤涼地面是醬香型白酒酒醅中酵母的主要來源[9]。由此可見，除高溫大曲以外，環境因素對酒醅中酵母的富集亦具有重大貢獻。

3 醬香型白酒窖內發酵過程中酵母的研究

堆積結束后，酒醅入窖池進行厭氧發酵，是產酒的關鍵時期。酵母是乙醇發酵的主要動力，因而研究窖池內部酵母結構和變化，對認識和科學指導窖內發酵過程意義重大。

3.1 醬香型白酒窖內酒醅中酵母消長規律

酒醅中酵母的變化因時間和空間而異。從時間的角度看，酒醅入窖之后，酵母菌數量隨著發酵時間的推進呈現出下降的趨勢。郎酒廠通過對第四輪次入窖酒醅中酵母菌進行跟蹤，表明酵母在進入窖池發酵后，雖然各層酵母數量在不同發酵時間顯現出回升的顯現，但酵母總體數量呈下降趨勢，能從入窖時的108CFU/g糟下降至出窖時的104CFU/g糟[16]。習酒技術中心通過對多輪次窖內發酵過程進行研究，表明隨著窖內發酵時間的推移，酒醅中酵母總數量與各醅層中酵母數量變化一致，均呈急劇-緩慢下降的趨勢[17-18]。窖內發酵過程中的酵母主要源于堆積過程所繁殖的酵母，這也反應出堆積過程對窖內過程具有重要作用。酵母菌入窖發酵過程中呈現出的數量下降趨勢可能是因為隨著發酵進行，窖池內氧氣和營養物質逐漸被消耗，代謝產物積累，酸度升高等環境因素的改變，導致了酵母的逐漸衰亡。此外，通過對醬香型白酒生產多輪次入窖酒醅進行對比分析，發現那些酒質較差輪次酒醅中的酵母數量明顯少于那些酒質好輪次酒醅中酵母的數量，而各輪次中酵母數量下降速率因各輪次酒醅溫度、營養物質和代謝物含量不同而異[17]。

從空間的角度來看，醬香型白酒酒醅不同醅層中酵母分布具有明顯差異。課題組對醬酒廠3個不同窖齡窖池中酵母數量變化進行了跟蹤，發現無論是對于新窖池還是老窖池來說，酵母總體分布趨勢均是上層酵母數量最多，其次是中層，而下層酵母數量最少[3]。郎酒酒廠和習酒酒廠也有相似的研究報道[12]。發酵過程中，上層酒醅中酒精含量高于中下層，這與糟醅中酵母的數量變化趨于一致[16]。在某種程度上，上層酒醅可能通過封窖泥中縫隙與外界實現了氣體交換，使得越靠近上層的酒醅中氧氣濃度高于靠中下層的酒醅中的氧氣濃度，因而上層酒醅環境更適宜酵母的生長，這可能是酵母在窖內空間分布差異的原因之一。

3.2 醬香型白酒窖內酒醅中酵母多樣性

江南大學對醬香型白酒窖內發酵過程中酵母的結構組成做了比較全面的研究。以傳統分析方法對醬香型白酒窖內發酵過程中酵母組成變化進行跟蹤，發現同一輪次三層酒醅中酵母種屬基本沒有差別，但是優勢酵母種類隨發酵時間推進，發生了明顯變化；Pichia galeiformis、拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是不同輪次窖池發酵上層酒醅中主要的4種酵母，但是優勢酵母的種類因輪次而異，表現為拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是二、三、四輪次中最主要的2種酵母，隨發酵時間推進，栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）成為了五、六、七輪次中的優勢酵母，而Pichia galeiformis數量隨輪次進行一直在降低；從窖內酒醅中還分離得到了Pichia fabianii、白地霉（Geotrichum candidum）、Pichia meyerae、膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）等酵母[10]。以變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術分別對酒質好與酒質差的兩個輪次發酵過程中的酵母群落結構進行解析，表明兩輪次中優勢酵母的種類不同，酒質較好的輪次中酵母數量更多，種類也更為豐富；隨發酵時間推進，酒質較好的輪次比酒質較差的輪次中酵母群落結構更為穩定；檢測出東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、Pichia galeiformis、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、白地霉（Galactomyces geotrichum）、Trichosporon asahii、拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、費比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）等9種酵母[18]。同時茅臺酒廠對窖池中酵母研究表明拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是上層酒醅中的優勢酵母，且酒質較好的輪次酵母生物量多于酒質較差輪次，這同上述研究均具有相似性[17]。此外，對北大倉白酒窖池中酵母組成進行跟蹤分析，表明在其生產發酵過程中酵母菌的組成和分布相對穩定，嗜酒假絲酵母（Candida ethanolica）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、Candida humilis、布魯塞爾德克酵母（Dekkera bruxellensis）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是常見酵母，而Pichia manshurica、Kazachstania barnettii、Kazachstania exigua、Pichiaanomala等酵母屬于稀有酵母[19]。課題組對醬香型白酒窖池中酵母進行歸類分析，發現窖內酵母主要歸為五大類，包括釀酒酵母屬（Saccharomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）、畢赤氏酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）及伊薩酵母屬（Issatchenkia），這些酵母在上層酒醅中均有檢出，但在中層和下層酒醅中存在一定的差異[3]。

4 醬香型白酒功能酵母研究及應用

從制曲、堆積到入窖發酵，酵母在白酒整個生產過程中均可以檢測到，是白酒釀造過程中的重要的三大菌群之一。研究醬香型白酒生產中的酵母，不僅能夠為認識醬香型白酒發酵機理提供依據，而且能將其應用到白酒的生產中，提高酵母資源的利用率和醬香型白酒的質量。

4.1 酵母主要功能的研究

白酒生產中，酵母從功能上主要將分為兩大類。一類是產酒酵母，其發酵能力強，主要影響產酒率；另一類是產脂酵母，其發酵效率低，但能以糖、醛、有機酸、鹽類等作為養料，在酯酶的作用下將醇酸結合而產生酸酯物質，從而賦予酒體濃郁的芳香，對酒體完美和豐滿具有重要作用，因而又稱為生香酵母。

4.1.1 產酒酵母的研究

在酒精生產中，考慮到實際生產成本以及隨著發酵進行帶來的條件改變，往往需要生產菌種具有良好的發酵能力和對不良環境具有較高的抗性或耐受性。在醬香型白酒生產的過程中，隨著微生物代謝，會形成溫度高、酸度大和滲透壓大的環境。在這種環境的長期馴化下，制酒環境中出現了一些具有良好發酵力并具有良好耐受性的酵母。曾從醬香高溫大曲中分離出的耐高溫卡斯特假絲酵母（Candida casterllani）在45℃時仍然具有較高的發酵性能，并且在不同環境中具有較強的耐受性[7]。從醬香型白酒堆積糟醅中篩選到一株耐高溫酵母，其在45℃時生長良好并具有一定的發酵力和耐受性[20]。從醬香型白酒酒醅中分離的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Kazachstania exigua、白地霉（Geotrichum candidum）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、Candida krusei這幾種酵母具有發酵起始快、發酵能力強、對糖的利用能力高等特點，并且釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）展現出較強的酒精耐受性，而Kazachstania exigua展現出較強的耐酸性[11]。本課題組從醬香型白酒酒醅中篩選出兩株產酒能力強的酵母，即東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和粉狀畢赤氏酵母（Pichia farinosa var.farinosa），其乙醇質量分數分別達69.13%和61.61%[3]。陳良強等[21]從醬香型白酒大曲和酒醅中篩選出的四株高產乙醇的酵母，其中栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）MT-14乙醇產生能力與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及參照菌株持平，但異丁醇和異戊醇產量明顯偏低，且對高溫、酸和乙醇等均具有較強的耐受性。該研究對降低醬香型白酒中雜醇油含量、提高酒質及發酵效率具有重要價值。可見從制酒環境中篩選的產酒酵母在生理生化特性上與制曲和制酒環境表現出一定適應性。

4.1.2 產香酵母的研究

傳統認為非產酒酵母在白酒生產中地位較低，對白酒的生產意義不大。隨著對這些酵母產香現象認識的加深，發現產香酵母能產生大量具有香味的醇、酸、酯類等物質，如苯乙醇、苯乙酸具有玫瑰風味，乙酸苯乙酯具有玫瑰花香、粉香、蜂蜜樣香氣，γ-癸內酯有類似椰子和桃子的香氣，乙酸乙酯具有水果香味等。現在認為產香酵母產生的香味物質對白酒風味的形成貢獻很大，因而研究醬香型白酒生產中的產香酵母十分必要。

茅臺酒廠技術中心分離得到2株制酒發酵中產酒和產香主要的功能酵母，其固態發酵實驗表明，這2株酵母能夠產生多種香味物質[6]。本課題組從醬香型白酒酒醅中篩選出的平常假絲酵母（Candida inconspicua）和庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）表現出較強香味物質生產能力，其中以乙酸乙酯、異戊醇、乙酸苯乙酯產量較高[3]。東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）能夠產生檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸類和大量的高級醇類物質，還能產生少量乙醛影響乙醇發酵[19]。卡斯特假絲酵母（Candida casterllani）除了能產生乙醇外，也能產生乙醛、乙酸乙酯、異丁醇等香味物質[7]。從醬香型習酒高溫堆積糟醅中分離出的意大利酵母（Saccharomyces italicus）、地生酵母（Saccharomyces telluris）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和間型假絲酵母（Candida intermedia）不僅具有一定的發酵能力，其發酵液還呈現出不同程度醬香、酯香和醇甜香味，對其次生代謝產物進行分析表明，該4種酵母能產生多種酸、醇、酯等物質。此外，還發現葡萄糖和蛋氨酸能在意大利酵母（Saccharomyces italicus）酶促下發生美拉德反應，從而使得發酵液呈現出濃郁的芝麻香，該香味的主要成分為3-甲硫基-丙醇-1和5-羥基麥芽酚[13，22]。通過對膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）在不同環境下的代謝產物進行分析，表明該酵母主要產生酸、醇類以及少量特殊呈味物質，發酵產物中含有較為豐富的苯乙醇、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等，還能產生降低膽固醇和血脂的功能性物質亞油酸乙酯[23]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、Candida krusei、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、拜耳結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Kazachstania exigua、白地霉（Galactomyces geotrichum）均對高級醇、酸、酯、醛等風味成分的貢獻很大[11]。茅臺酒廠從醬香大曲中分離得到的白地霉（Geotrichum candidum）MTBD能產生酸類、酯類、醛酮類等多種成分，并與茅臺酒風味成分相似性高[24]。此外，絲孢酵母屬（Trichosporon）、漢遜酵母屬（Hansenula）和假絲酵母屬（Candida）的酵母菌均具有一定的產香能力。關于產香酵母的研究一直在進行，隨著研究的深入，不僅能為醬香型白酒風味形成機理提供參考，亦為利用產香酵母來改善和強化白酒風味提供了理論支撐。

4.2 其他功能的研究

醬香型白酒發酵過程不是單菌作用過程，而是多菌參與、混合發酵的結果，因而僅僅是從酵母的角度來研究酵母的功能及作用并不全面。相應地，混菌發酵研究能從其他角度來說明酵母在白酒發酵中的作用，因而亦是當今研究的熱點。目前，研究發現釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與米曲霉（Aspergillus oryzae）XJ10混菌發酵時，適當條件下，能夠顯著提高乙醇產量、酵母生物量以及酯類、酸類、醇類、醛酮類等風味物質的濃度，特別是對白酒風味具有重要作用的苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸、3-甲基-丁醇等化合物的濃度[25]。其他研究還發現釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與異常畢赤酵母（Pichia anomala）混菌發酵時，能夠產生更多的酯類物質，降低了發酵液中高級醇和總酸的含量，有效地改善了發酵液的風味[26]。這些研究不僅為傳統固態發酵生產醬香型白酒中微生物代謝研究提供了科學依據，也對指導實際生產具有重要作用。此外，本課題組從醬香型白酒大曲和酒醅中篩選到一株能在丟糟中大量繁殖的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在適當條件下，能將固態白酒丟糟有效轉化為高蛋白飼料和酵母菌劑，既能實現資源的充分利用，也提高了酵母的經濟學價值[27]。

4.3 功能酵母的應用

如何將功能酵母應用來提高出酒率和豐滿酒體風格一直是企業技術人員和科研人員的研究熱點。茅臺酒廠技術中心將老車間成熟堆醅投入到新制酒車間的堆子和窖池中，改善了新車間中5種功能菌株（包括兩種酵母和3種芽孢細菌）分布異常的情況，明顯提高了輪次酒的質量[6]。馬榮山等[28]從麩曲醬香型白酒酒醅中分離得到7株酵母菌，通過制曲篩選出5株酶活力高、發酵力強的酵母菌，將其作為酒曲發酵菌種，生產出的酒的醬香味突出，酒體清亮透明，綿甜醇厚，具有明顯的醬香風格。將醬香型酒堆積糟醅中的優勢酵母應用到實際生產中，所產酒酯香味突出，醇甜味要比標準酒樣顯著[29]。以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和米曲霉（Aspergillus oryzae）XJ10制作麩曲投入實際生產發酵，在適當比例之下，能夠在保留好的風味和口感的前提下明顯提高出酒率，增加了生產效益[25]。本課題組擬將分離得到的一株既產酒又產香的酵母應用到醬香型白酒生產中，旨在探究該酵母是否能夠對生產工藝進行強化，經濟學價值如何。可見將功能酵母投入實際生產取得了一些可喜的成果，但僅僅通過向醬香型白酒生產工藝中加入功能酵母來對工藝進行強化容易造成調控的盲目性，不一定能達到預期的效果。隨著對酵母功能和特性、相互作用機制的深入研究，相信如何最大程度地利用這些功能酵母會形成一套特殊的理論，來科學地指導實際生產。

5 醬香型白酒釀造體系中酵母分析技術的研究

純培養技術是傳統的分析方法，廣泛用于企業和科研單位初期樣品微生物的分離、計數以及功能微生物的篩選。采用平板分離法對樣品中酵母進行培養，通過形態特征及其生理生化特性以及分子特性等來對酵母進行鑒定，結合計數結果來分析酵母在醬香型白酒生產中的分布情況、消長規律以及多樣性等，并在醬香型白酒的研究中取得了較多的成果。

生長環境的復雜性以及培養條件的限制，使得樣品中只有1%的微生物可培養，因而純培養技術不能對樣品酵母群落結構做出完整地分析。直接以樣品內全部微生物為研究對象的免培養群落分析技術得到了迅速發展，為完整而客觀地分析樣品中酵母結構提供了可能。目前用于白酒微生物研究的免培養技術有BIOLOG ECO微平板技術、磷脂脂肪酸譜和一些分子生物學技術，如擴增核糖體DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDAR）、限制性片段長度多態性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP）、變性梯度凝膠電泳、單鏈構象多態性技術（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、隨機擴增多態性DNA標記技術（random amplifiedpolymorphim DNA，RAPD）、熒光定量PCR技術等[30]。利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術對醬香型白酒酒醅中酵母群落結構進行分析表明，酒醅中酵母種類豐富，優勢酵母種類以及窖池中酵母群落結構的穩定性隨發酵輪次而異。并對通過對各輪次酵母種類和生物量、乙醇產量以及酒醅中揮發性化合物的差異分析闡述了酵母菌群結構變化對醬香型白酒風味組分的影響[18]。對醬香型郎酒大曲中酵母的DGGE指紋圖譜的分析表明，醬香型郎酒高溫大曲中仍然存在多種酵母，不同工藝大曲酵母多樣性和大曲制曲溫度并沒有呈一定的相關性[10]。采用克隆文庫技術與聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術相結合的手段，分析不同香型大曲微生物群落組成，發現醬香型郎酒大曲中Trichomonascus ciferrii是主要的酵母[4]。

以上免培養技術受到微生物數量、反應條件等因素的影響，在一定程度上限制了對樣品微生物的全面認識。隨著第二代高通量測序技術的出現和發展，大規模測序成為可能，能夠對樣品中微生物群落結構做出更加快速和準確地分析，并在白酒微生物的研究中逐漸成為研究熱點。如黃祖新[31]早前便對將宏基因組技術應用到白酒大曲微生物的研究中進行了論述，提出宏基因組技術在挖掘大曲中微生物資源、基因資源、酶資源，以及全面探究不同大曲酒微生物群落多樣性及其變化規律的可能性，進而對全面了解大曲中微生物代謝機制及破解醬香型白酒香味組成物質提供理論支撐。目前，應用宏基因組技術來研究醬香型白酒中細菌群落結構的研究已有報道，但是對酵母群落結構的研究仍然空缺。

6 總結

綜述醬香型白酒制曲和釀造過程中酵母動態變化規律，對控制醬香型白酒生產以及工藝的穩定性和規范性具有指導意義；研究酵母的功能對控制白酒質量具有重要作用，并在一定程度上能夠利用功能酵母來對醬香型白酒生產工藝進行強化，提高酒質；對技術的研究，為釀造過程中酵母組成和變化形成完整而系統的分析提供了可能。隨著研究的深入以及技術的發展，醬香型白酒的發酵機理將得到更加合理的解釋。

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Research progress of yeast in Moutai-flavor liquor production

CHEN Meizhu1,3,QIU Shuyi1,2,HU Baodong1,2,WANG Jing1,2,XU Jia1,2,WANG Xiaodan1,2,3*
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

This paper reviewed the research progress of the diversity,growth and decline rules,functions and applications of yeast in Moutai-flavor liquor production from Daqu making-process,stacking-process of fermenting grains to the fermentation process in pits.Besides,the relevant technologies in yeast analysis in Moutai-flavor liquor production were also introduced.Cognizing the yeast during the production process of Moutai-flavor liquor with multiple perspectives was not only referential to reveal the fermentation mechanism of Moutai-flavor liquor and improve the quality of the liquor,but also had directive significance to control the stability and normalization of the production technology.

yeast;growth and decline rules;diversity;function;application;analysis technology

TS 262.3

A

0254-5071（2015）06-0005-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.002

2015-05-17

貴州省科技廳重點攻關項目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省科技廳重大專項項目（黔科合重大專項字[2013]6009號）；科技部科技支撐計劃項目課題（2011BAC06B12）；貴州省科技廳聯合資金項目（黔科合LH字[2014]7672）

陳美竹（1991-），女，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。

*通訊作者：王曉丹（1980-），女，工程師，博士研究生，研究方向為應用生物技術。