醫療機構使用中消毒劑的微生物污染檢測及消毒劑供試品無菌檢驗的分析

祝艷云，曹萍

吉林省敦化市疾病預防控制中心，吉林敦化 133700

為了掌握該市各級醫療機構使用中消毒劑微生物污染情況，加強使用中消毒劑的管理，降低院內感染率。在使用現場采集各醫療機構使用中消毒劑,對采集的消毒劑進行污染菌檢測；《醫療衛生消毒標準2012版 （合訂本）》。

1 資料與方法

1.1 樣品采集

用無菌方法采取被檢消毒藥10 mL，加入到20 mL無菌試管中，4 h內送檢。

1.2 檢驗過程

1.2.1 菌落總數測定 （1）樣品處理：用無菌吸管吸取消毒液1.0 mL，加入到9.0 mL含相應中和劑的無菌生理鹽水中，震蕩20 s或80次，取1:10稀釋液進行檢測。

（2）實驗步驟：利用滅菌后的吸管提取稀釋10倍的檢測液，共提取2 mL，將檢測液分別注入兩個消毒后的培養皿上（每份1 mL）。然后再取去同樣的檢測液1 mL，將其加入到9 mL的無菌生理鹽水當中，充分震蕩約20 s后制成稀釋100倍的檢測液，再提取2 mL該檢測液，將其分別注入兩個消毒后的培養皿內。選擇普通瓊脂放入水浴鍋中融化，待其冷卻到50℃左右后傾倒在各培養皿上，每個培養皿內傾倒約15 mL，傾倒后立即搖動培養皿，使內部的瓊脂能夠與檢測液充分的緩和。待瓊脂完全凝固后可采用倒置培養方法，恒溫培養箱的溫度設定為36℃，培養時間為48 h。另外選擇一個空白無菌培養皿，將制備的瓊脂倒入其中，待自然凝固后放入恒溫培養箱內，溫度和培養時間與檢測液相同，作為對照組。

（3）實驗報告：在培養完畢后利用肉眼對培養皿中菌落的數量進行觀察，在完全記錄菌落數量后，將其放在5～10倍的電子放大鏡下進行復查，提高菌落計數的準確率。記錄同一稀釋濃度下培養皿內菌落的數量，取平均值作為菌落生長數。選擇其中菌落生長數量在30～300之間的培養皿，將菌落數與1 mL消毒劑內所含有的菌落數量相乘，單位設定為CFU/mL，如果一個稀釋度內無病菌生長，其報告內菌落指數應低于10 CFU/mL。

1.2.2 霉菌、酵母菌的測定 （1）實驗步驟：選取稀釋度為10倍、100倍和1 000倍的檢測液1 mL，分別將其注入到無菌培養皿中，每個稀釋度檢測液各放入兩個培養皿中。選擇沙堡羅瓊脂放入水浴鍋內融化，在溫度冷卻到45℃時，將瓊脂倒入培養皿當中，并立即進行搖動混勻，采用倒置方法在恒溫培養箱內進行培養。培養箱內溫度設定為28℃，培養時間為72 h，在培養結束后詳細記錄培養皿上霉菌和酵母菌的數量。另外需要選擇一個未添加檢測液的無菌培養皿，將沙堡羅瓊脂倒入培養皿內，并在瓊脂凝固后放入恒溫培養箱當中，溫度和培養時間也檢測液相同，作為對照組。

（2）實驗報告：先對每一個培養皿上生長的菌落數量進行統計，并計算每個稀釋濃度菌落數量的平均值，選擇菌落生長數量在5～50的培養皿，將菌落數與稀釋倍數相乘，所得結果即為每毫升消毒劑當中所含有的霉菌和酵母菌的總數。

1.2.3 致病菌的檢測 （1）金黃色葡萄球菌的檢測：①病菌培養方法：選擇稀釋10倍的檢測液，將其加入兩倍濃縮的氯化鈉肉湯當中，該肉湯的濃度為7.5%，其中檢測液共10 mL、肉湯10 mL。將該培養皿放入恒溫培養箱中進行培養，溫度設定為36℃，培養時間為24 h。②病菌分離培養:利用接種環將培養皿當中的病菌取出，采用劃線法進行接種，培養基為血瓊脂培養基。將該培養基同樣放置在溫度為36℃的恒溫培養箱內培養，培養時間為48 h。金黃色葡萄球菌通過血瓊脂培養后整體呈金黃色，菌落大而突出，外形為光滑圓形，并且在菌落周圍可見明顯的溶血圈。利用接種環挑取單個菌落進行分離提純，采用同樣的溫度培養24 h。③菌落染色和鏡檢:選擇分裂提純培養后的菌落進行涂片，利用革蘭氏染色法，金黃色葡萄球菌呈陽性，在電子顯微鏡下其菌株排列成葡萄狀，并無芽孢分布，具有致病性的葡萄球菌個體較小，一般直徑在1μm以下。④甘露醇發酵試驗:選擇分離培養后的菌株，將其接種在含有甘露醇的瓊脂培養基上，在溫度為36℃的環境中培養24 h，能夠使甘露醇發酵并產生酸性物質者判斷為陽性。⑤血漿凝固試驗:選擇稀釋4倍的人新鮮血液0.5 mL，將其加入到無菌試管當中，并加入通過肉湯培養的檢測菌落0.5 mL，充分混勻后放入恒溫培養箱內，溫度設定為36℃，每隔0.5 h觀察1次試管，如果試管內血液在6 h內出現凝塊情況，則判斷其為陽性。⑥實驗報告:該次實驗當中所生長的菌落，通過染色和鏡檢之后，如為金黃色則判定為革蘭氏陽性葡萄球菌，其能夠對甘露醇產生發酵反應，并且凝血實驗也呈陽性，說明檢出菌落為金黃色葡萄球菌。

（2）銅綠假單胞菌的檢測：①病菌培養:選擇稀釋度為10倍的檢測液10 mL，將其接種在普通肉湯當中，該肉湯共濃縮2倍，劑量為10 mL，將檢測液放置在36℃環境中進行培養，培養時間為24 h。如肉湯上方生成一層菌膜，并成黃綠或藍綠色，則說明有銅綠假單胞菌生成。②病菌分離培養:利用接種環挑取菌落，采用劃線法接種在培養皿上，該培養基的昂中含有十六烷三甲基溴化銨，將培養皿放置在36℃環境下培養24 h。該菌落生長無明顯形狀，以向四周隨機蔓延為主，菌落表面濕潤，顏色為灰白色，菌落周圍還可見明顯的水溶性色素，顏色為綠色。③染色鏡檢:在培養皿當中挑取菌落，革蘭氏染色后呈陰性的，可以開展氧化酶實驗。④氧化酶實驗:選擇無菌白色濾紙放置在平皿底部，利用接種環將菌落涂抹在濾紙上，然后加入1%的二甲基對苯二胺試劑，如果在30 min內菌落顏色變為粉色，則說明氧化酶反應陽性，反之則為陰性。⑤綠膿菌素試驗:選擇菌落2～3個，將其接種在綠膿菌素鑒定培養基上，放置在恒溫培養箱內培養，溫度設定為36℃，時間為24 h。培養結束后選擇氯仿約5 mL加入培養皿，充分震蕩混合，使綠膿菌素能夠溶解在氯仿當中，此時如果試劑變為藍色，則將試劑轉移到空試管內，并加入1 mL鹽酸，震蕩后如果溶液上層為粉紅色，則判斷為陽性。⑥硝酸鹽還原產氣試驗:接種環挑取菌落，將其接種在含有硝酸鹽蛋白胨的水培養基當中，同樣放置在溫度為36℃的恒溫培養箱內，培養時間為24 h。培養后如果小試管有氣體產生，則判斷為陽性。因為銅綠假單胞菌能夠將亞硝酸鹽還原，并生成氮氣。⑦明膠液化試驗:對菌落進行提純培養，并采用穿刺接種的方式，將其接種在明膠培養基內部，放置在培養箱內24 h，培養完畢后直接放入冰箱保鮮層，大約0.5 h，如果取出后明膠呈液化溶解狀態，則說明呈陽性，反之呈陰性。⑧實驗報告：經過分離提純染色檢查后，證明檢測液中含有革蘭氏陰性菌，氧化酶和綠膿菌素的實驗結果均呈陽性，說明其中含有銅綠假單胞菌。而如果綠膿菌素實驗呈陰性，而液化明膠、硝酸鹽還原實驗均呈陽性，則仍可說明其中含有銅綠假單胞菌。

（3）乙型溶血性鏈球菌的檢測：①病菌培養:選擇稀釋度為10倍的檢測液10 mL，將其接種在含有濃度2倍的肉湯當中，該肉湯中含有葡萄糖，放置在36℃的恒溫培養箱內，共培養24 h。②病菌分離培養:用接種環挑取培養后的菌落，采用劃線接種方式，將其接種在血培養基中，同樣放置在36℃環境下，共培養24 h。該菌種在血培養基上生長的菌落顏色為灰白色，通常稱不透明狀態，菌落頂端具有針狀突起，并且邊緣光滑整齊，在菌落周圍還存在明顯的溶血圈。③染色鏡檢:接種環挑取菌落，革蘭氏染色后呈陽性，在鏡檢下菌落排列呈鏈狀。④觸酶試驗:利用接種環挑取菌落中心的菌體，將其接種在空載玻片上，選擇膠頭滴管在病菌上滴入濃度為30%的雙氧水，放置順序不可互換，否則會引發假陽性反應。觀察載玻片上是否有氣泡產生，如有氣泡則視為陽性，而乙型溶血性鏈球菌應呈陰性。⑤鏈激酶試驗:將0.02 g的草酸鉀與人體5 mL新鮮血液進行混合，經過充分離心后提取上清液備用。在草酸鉀血清中注入0.8 mL無菌生理鹽水，充分震蕩混合，然后將肉湯內培養的菌落加入試管中，并同時加入0.25 mL的氯化鈣試劑。將試管放入溫度為36℃的水浴鍋內進行孵化，每隔2 min對凝固程度進行觀察，在凝固后記錄血清的融化時間，如果凝固后2 min不出現融化情況，則將試管轉移到恒溫培養箱內培養24 h，培養后如血清融化，則說明為陽性。⑥桿菌肽敏感試驗:將菌落接種在血培養基上，利用消毒后的鑷子夾取含有0.04單位的桿菌肽試紙，并放入恒溫培養箱內，如果培養24 h后出現明顯抑菌帶，則判斷為陽性。⑦報告:被檢消毒劑經增菌培養后，經證實為革蘭氏陽性、呈鏈狀排列的球菌，觸酶陽性、鏈激酶試驗陽性、對桿菌肽敏感者，即可報告為檢出乙型溶血性鏈球菌。

2 結果

經檢測，21個被檢醫療機構的43個科室的使用中消毒劑合格率為82.6%，醇類消毒劑的合格率為92%，過氧化物類為79.3%，含氯消毒劑為97.6%，碘類消毒劑為98%,醛類消毒劑為76%，酚類消毒劑為99%；菌落總數超標率為5.5%，霉菌和酵母菌檢出率為1.3%，金黃色葡萄球菌檢出率為2%，銅綠假單胞菌檢出率為0.8%，乙型溶血性鏈球菌檢出率為1%，有些重要科室如產房，口腔科等重要科室，使用中消毒劑微生物污染嚴重，合格率較低[1]。

3 討論

對使用中消毒劑的配制和使用要做到：盛裝消毒劑的器皿在消毒劑配制前應進行消毒滅菌(高壓蒸汽滅菌或高溫干燥滅菌)，消毒劑配制過程中要無菌操作；使用前應認真閱讀產品包裝上的產品說明、使用范圍、使用方法和注意事項等，并嚴格遵照執行；消毒劑應放置于陰涼通風處，避光、防潮、密封保存；按產品說明，根據有效成分含量按稀釋定律配制所需濃度；多數消毒劑配置后穩定性下降，要現用現配、使用前監測濃度。連續使用的消毒劑要每日監測濃度，或每次使用前監測濃度；用過的醫療器械和物品，應先去除污染，徹底清洗干凈再消毒；用于浸泡消毒時容器應加蓋，并放于通風良好的環境中；消毒劑均有一定的腐蝕性，不宜長時間浸泡物品或殘留在物體表面，作用時間達到后要取出并采取有效措施去除殘留消毒劑；消毒人員要做好個人防護[2]。

對使用中的消毒劑要加強管理，對不合格的醫療機構監督整改，定期對使用中消毒劑進行抽樣檢測，對降低院內感染率，避免重大院內感染事故的發生，有著非常重要作用[3]。

[1]劉彩霞，等.醫院使用中消毒劑的監測結果分析與管理[J].中華醫院感染學雜志,2012,22(4):64-65.

[2]李曉娟,張以梅.消毒供應中心去污區個人防護依從性的調查與分析[J].中華醫院感染學雜志2015(20):4790-4791.

[3]蘇晶靜.探討供應室護理質量控制對降低院內感染的可行性 [J].中國衛生標準管理,2015(11):224-225.