急性髓系白血病中FIP1L1-PDGFRA基因突變的檢測及臨床價值

李志芹 盧燕 賈國榮014010內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院

急性髓系白血病中FIP1L1-PDGFRA基因突變的檢測及臨床價值

李志芹 盧燕 賈國榮
014010內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院

目的：探討急性髓系白血病患者FIP1L1-PDGFRA基因突變的檢測情況及臨床意義。方法：應用巢式PCR檢測86例急性髓系白血病患者外周血中FIP1L1-PDGFRA基因突變情況。結果：共6例急性髓系白血病患者檢測到FIP1L1-PDGFRA基因突變，其中M4EO 3例，M2 2例，M5 1例。結論：FIP1L1-PDGFRA基因突變可在急性髓系白血病患者檢測出，以M4EO多見。

FIP1L1-PDGFRA；急性；髓系；白血病

目前，血液腫瘤（白血病等）經過化學治療和骨髓移植取得了一定的效果，但是仍然不能有效解決白血病的復發。FIP1L1-PDGFRA（FIP1-like-1 platelet derived growth factor receptor）融合基因是由4q（12）一個800kb區段缺失所導致的[1]。Cools認為，FIP1L1-PDGFRA可能和BCR-ABL，c-KIT一樣都能產生各自的蛋白質而使自身的酪氨酸激酶活性增強，從而激活下游靶標轉錄活化因子5（STAT5）的信號傳導途徑，引起細胞增殖[2]。我們檢測急性髓系白血病患者細胞表面FIP1L1-PDGFRA的表達情況，如此基因陽性表達，可為急性髓系白血病患者提供另一種治療途徑，提高患者的總生存率。

資料與方法

2008-2011年收治急性髓系白血病患者（M3除外）86例，男48例（55.8％），女38 例（44.2％），年齡18～81歲，平均51歲；中位原始細胞比例0.85（0.35～0.98），外周血中位WBC 35.3（0.8～352.6）×109/L；按FAB分型，其中M0 3例（3.4％），M1 12 例（14.0％），M2 27例（31.4％），M4 32例（37.2％），其中 M4EO 7例，M5 9例（10.5％），M6 2例（2.3％），M7 1例（1.2％）。急性髓系白血病的診斷標準參考文獻[3]。

主要試劑及儀器：Ficoll分離液購自上海生工生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒購自北京思爾成生物技術有限公司。PCR儀為美國PE-9700型。

FIP1L1-PDGFRA的突變檢測：①細胞RNA抽提及逆轉錄：人中性粒細胞分離液分離出急性白血病患者外周血白細胞，富集約5×106/L細胞數，Trizol/氯仿提取粒細胞總RNA，取2 μg總RNA，用逆轉錄（RT）試劑盒進行cDNA的逆轉錄。②筑巢聚合酶鏈反應（PCR）體系及反應條件：具體引物序列為FIP1L1-F4 5'ACCTGGTGCTGATCTTTCTGAT 3'，PDGFRA -R1 5'TGAGAGCTTGTTTTTCACTGGA 3'，FIP1L1-F5 5′ AAAGAGGATACGAATGGGACTTG3'，PDGFRA-R25'GGGACCGGCTTAATCCATAG 3'。PCR總反應體積10 μL，引物濃度1.5～2.4 μmol/L，MgCl21.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，DNA高保真Taq酶1.5～2.5 U。熱循環條件：預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火54～56℃50 s～1 min，延伸

討論

72℃2～3 min，共30個循環，再總延伸10 min。PCR產物通過電泳、銀染鑒定。同時，對1例健康志愿者及1例慢性粒細胞白血病（CML）患者進行同條件RT-筑巢PCR，以作為FIP1L1-PDGFRA的陰性對照。

結果

急性髓系白血病患者中存在FIP1L1-PDGFRA基因的突變：在86例急性髓系白血病患者中，共發現6例患者FIP1L1-PDGFRA基因陽性，其中以伴嗜酸粒細胞增多的M4患者最多，占總陽性患者的50％，其次發現2例M2患者陽性，1例M5患者陽性。6例患者均有3～4個不同大小的 DNA片段（300～1 000bp），代表不同的斷裂點。健康人及慢性粒細胞白血病患者均無此片段。

FIP1L1-PDGFRA基因突變陽性的急性髓系白血病患者6例患者經DA或IA進行誘導緩解后均取得完全緩解，似乎未見明顯預后不良。

FIP1L1-PDGFRA（FIP1-like-1 plate-let derived growth factor receptor）融合基因是由4q（12）一個800 kb區段缺失所導致的。FIP1L1和PDGFRA的缺失斷點在FIP1L1的5'端和PDGFRA的3'端重新融合，形成FIP1L1-PDGFRA融合基因，其中FIP1L1的斷裂點散落在一個40 kb的區域，其個體變化較大，而PDGFRA的斷裂點非常嚴格地局限在一個非常小的固定的包含PDGFRA的12外顯子的區域，Cools認為，FIP1L1-PDGFRA可能和BCR-ABL，c-KIT一樣都能產生各自的蛋白質而使自身的酪氨酸激酶活性增強，從而激活下游靶標轉錄活化因子5（STAT5）的信號傳導途徑。伊馬替尼（Imatinib mesylate），商品名格列衛（Gleevec）作為一種酪氨酸激酶抑制劑，自2001年上市以來，廣泛應用于BCR-ABL陽性的慢性粒細胞白血病、急性淋巴細胞白血病，并取得良好的效果。2003年，Cools等與Griffins等分別在HES患者及體外培養的EOL21細胞（慢性嗜酸性粒細胞白血病細胞系）中檢測到FIP1L1-PDGFRA融合基因，此后多位學者均證實應用伊馬替尼治療FIP1L1-PDGFRA陽性的嗜酸粒細胞增高癥取得了良好的效果，有效率70％左右[4～5]。因此，FIP1L1-PDGFRA融合基因的檢測，可作為格列衛治療選擇的一種“指示路標”。2007年G metzgeroth等首次報告5例FIP1L1-PDGFRA陽性急性髓系白血病（M0 2例，M2 2例，M4 1 例）和1例T細胞非霍奇金淋巴瘤患者經伊馬替尼治療后達到了血液學緩解且分子學持續緩解平均達20個月以上[6]。同樣我們也檢測到2例M2患者表達FIP1L1-PDGFRA基因突變，預示部分M2的患者可能會表達此基因。Donald Macdonald等認為，目前的常規染色體檢測技術無法檢測到del4q（12），必需采用RT-PCR或FISH才能檢測到其染色體缺失。王艷芳等應用FISH檢測嗜酸粒細胞增高癥患者4q（12），陽性率17％[7]，因此，應用染色體或FISH檢測陽性率較低，使用PCR檢測FIP1L1-PDGFRA融合基因可能會獲得更高的陽性率。

我們應用PCR方法檢測FIP1L1-PDGFRA融合基因陽性率較低，僅占全部急性髓系白血病患者的7％。但在6例陽性患者中伴嗜酸粒細胞增高的急性白血病患者FIP1L1-PDGFRA融合基因突變陽性率較高，占所有陽性患者的50％，在7例M4EO患者中，基因突變的陽性率43％，表明M4EO患者易表達此基因突變。其次發現2例M2患者，占總M2患者的7％，陽性率較低，但此型患者也應該常規檢測此融合基因。首次檢測到了1 例M5患者基因突變陽性。此6例患者經過標準誘導方案的治療全部達到完全緩解。此研究為復發的患者應用伊馬替尼治療提供了實驗室的依據，目前應用伊馬替尼治療FIP1L1-PDGFRA融合基因陽性的嗜酸粒細胞增高癥已經取得了良好的效果。

但此項研究所獲得的FIP1L1-PDGFRA融合基因突變的陽性例數太少，無法判斷此突變對患者預后的影響，需要繼續擴大病例進行進一步的研究，觀察是否有更多的急性髓系白血病亞型表達此基因，為臨床提供另一種可能有效的治療方法。

[1]C Walz，J Score，J Mix，et al.The molecular anatomy of the FIP1L1-PDGFRA fusion gene[J].leukemia，2009，23：271-278.

[2]Cools J，DeAngelo DJ，Gotlib J，et al.A tyrosine kinase created by fusion of the PDGFRA and FIP1L1 genes as a therapeutic target of imatinib in idiopathic hypereosinophilic syndrome[J].N Engl J Med，2003：348：1201-1214.

[3]張之南，沈悌.血液病診斷及療效標準[M].北京：科學出版社，2007：106-116.

[4] 李斌，張廣森.伊馬替尼治療高嗜酸細胞綜合征FIP1L1-PDGFRA融合基因變化的動態監測[J].中華血液學雜志，2006，27（2）：125-126.

[5]A Pardanani RP，Ketterling CY，Li，et al.FIP1L1-PDGFRA in eosinophilic disorders：Prevalence in routine clinicalpractice，long-term experience with imatinib therapy，and a critical review of the literature[J].Leukemia Research，2006，30（1）：965-970.

[6]G Metzgeroth，C Walz，J Score，et al.Recurrent finding of the FIP1L1-PDGFRA fusion gene in eosinophilia-associated acute myeloid leukemia and lymphoblastic T-cell lymphoma[J].leukemia，2007，21：1183-1188.

[7]王艷芳，郤連永，王化，等.應用FISH技術檢測嗜酸性粒細胞增多癥PDGFRA基因異常表達[J].中國實驗血液學雜志，2014，22（5）：1377-1380.

Detection of FIP1L1-PDGFRA gene mutation in patients with acute myeloid leukemia and its clinical value

Li Zhiqin，Lu Yan，Jia Guorong
The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Inner Mongolia Science and Technology University 014010

Objective：To investigate the detection of in patients with acute myeloid leukemia and its clinical value.Methods：Detection of FIP1L1-PDGFRA gene mutation for 86 patients with acute myeloid leukemia in peripheral blood using nested PCR.Results：There 6 patients with acute myeloid leukemia had FIP1L1-PDGFRA gene mutation，including 3 cases of M4EO，2 cases of M2，1 cases of M5.Conclusion：FIP1L1-PDGFRA gene mutation can be detected among patients with acute myeloid leukemia，and most of its type was M4EO.

FIP1L1-PDGFRA；Acute；Myeloid；Leukemia

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.17.70

內蒙古自治區高等學校科學研究項目（NJZY07128）

Foundation item The scientific research project of the Inner Mongolia Autonomous Region Colleges（NJZY07128）