銀杏葉提取物EGB761對高膽固醇血癥家兔血腦屏障通透性的影響*

王 強，姜希娟，范英昌，張瑞峰，郭茂娟，馬東明，盧 斌

近年來，高膽固醇血癥的發病率呈現上升態勢，隨著血中膽固醇濃度的升高，血腦屏障的完整性可能會遭到破壞[1]。而銀杏葉提取物作為一種可調節膽固醇的中藥有效成分，是否可以維持血腦屏障的完整性，目前研究甚少。因此，本研究參照Sparks等的方法復制高膽固醇血癥家兔模型，觀察銀杏葉提取物德國常用類型EGB761，對高膽固醇血癥家兔的血腦屏障（BBB）完整性是否產生影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 銀杏葉提取物EGB761（商品名：金納多），德國威瑪舒培博士藥廠，批號:9840808。辛伐他?。ㄉ唐访嘿惙蚨。?，南通華山藥業有限公司，批號：081202。其余試劑均為市售分析純。

1.2 動物模型的建立 39只健康成年雄性新西蘭大白兔（軍事醫學科學院實驗動物中心），體質量為（2 356±212）g，先給予普通飼料和自來水適應喂養2周，溫度（28±2）℃，濕度為 37%～48%。2周后，隨機取出9只作為對照組，飼以普通飼料，直到實驗結束，共9周。其余30只家兔參照D.Larry Sparks等的方法，采用2%高膽固醇飼料喂養6周，以復制高膽固醇血癥家兔的造模[2]。此時對照組血清總膽固醇一般低于60 g/L，其他各組血清總膽固醇若高于1 400 g/L，提示高膽固醇血癥模型復制成功，為達到1 400 g/L者則要淘汰出實驗。結果30只家兔造模成功28只，淘汰2只，另因高膽固醇血癥導致腦部疾患死亡2只。

1.3 實驗分組及處理方法 將26只造模成功的家兔隨機分為模型組（n＝8），繼續給予高膽固醇飼養3周。（由于停用膽固醇飼料后，家兔膽固醇水平會很快降低，故須繼續給予高膽固醇）。陽性藥辛伐他汀組（n=8），辛伐他汀5 mg/（kg·d）灌胃3周，其余處理同模型組。EGB761組（n＝10），EGB76150mg/（kg·d）灌胃3周，其余處理同模型組（上述藥物劑量為“按照成人體表面積折算的等效劑量”）。藥物干預結束后，次日空腹、稱質量。將所有家兔從耳緣靜脈注射25 mg/kg伊文思蘭（EB），3 h后麻醉，采用生理鹽水心臟灌流，至右心耳流出無色清亮液體為止，斷頭取海馬、嗅球和皮質。

1.4 伊文斯藍（EB）測定 制作標準曲線：稱取4 mg EB，加生理鹽水至總容積25 mL，然后取0.3 mL置于試管中，加入5.7 mL的甲酰胺，濃度為8 mg/L，作為第1管。再從第1管中取出3 mL液體，并加入3 mL甲酰胺作為第2管。以此類推共稀釋7管，其濃度依次為 8、4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg/L，以此梯度濃度制作標準曲線。按照2 mL/g腦組織濕質量加入甲酰胺。室溫避光孵育72 h，然后10 000 g離心10 min，收集上清。用熒光分光光度計在620 nm的條件下進行比色，依據其OD值計算出EB的濃度，以每克腦組織濕質量內所含EB的量（μg）表示。

1.5 統計學分析 采用SPSS16.0軟件包進行分析,數據以均數±標準差（s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有統計學差異。

2 結果

模型組血腦屏障EB含量顯著升高，與對照組相比有統計學差異，見表1。

3 討論

實驗以EB透過量作為BBB破壞的示蹤劑，觀察BBB的通透性，是因為EB的分子量與血漿白蛋白相近,且進入血漿后可與白蛋白結合，而血漿白蛋白在BBB損傷的狀況下可最優先透過BBB[3-7]。采用伊文思蘭透過實驗，發現高膽固醇飲食家兔腦組織EB含量增加，間接反映了高膽固醇可以提高BBB的通透性。研究結果與以往研究相一致：高膽固醇飲食家兔BBB的通透性明顯升高[8]。其機制可能是：高膽固醇飲食誘導血膽固醇濃度升高，繼而導致BBB上緊密連接蛋白如閉鎖小帶蛋白（ZO-1）、occludin等失調，從而引發BBB完整性的缺失有關[8]（該資料將在另外文章中闡述）。

表1 銀杏葉提取物EGB761對嗅球、海馬、皮質EB含量的影響（s）μg/g

表1 銀杏葉提取物EGB761對嗅球、海馬、皮質EB含量的影響（s）μg/g

注：與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別對照組模型組辛伐他汀組EGB761組皮層EB 0.25±0.03▲0.39±0.03 0.39±0.02 0.39±0.02 n988 10嗅球EB 0.25±0.01▲▲0.45±0.03 0.38±0.01▲▲0.38±0.01▲▲海馬EB 0.15±0.03▲▲0.41±0.03 0.36±0.04▲0.36±0.05▲

銀杏葉提取物是從銀杏科植物銀杏葉中分離純化的提取物，主要成分為黃酮糖苷類和萜烯內酯類物質。EGB761作為一種公認的銀杏葉提取物標準制劑，其對各種腦損傷的保護作用已引起國內外的廣泛關注。但是，EGB761是否可以調節高膽固醇引發的BBB通透性尚未見報道。實驗結果顯示銀杏葉提取物EGB761可以有效降低嗅球和海馬部位BBB的通透性。與陽性藥物辛伐他汀相比其療效沒有顯著性差異，說明銀杏葉提取物EGB761可有效保護BBB完整性，然而對皮質量BBB的完整性保護作用并不明顯。其作用機制可能與抑制claudin的磷酸化，而磷酸化的claudin可干擾緊密連接的形成[9]，從而有可能糾正BBB上occludin等的失調有關，然而其詳細機制尚待進一步闡明。

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