抗白色念珠菌海洋真菌的篩選及抑菌活性初探

王勇勇，蒙春蕾，蔡 爽，黃 敏，孟慶恒，孫建華

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

抗白色念珠菌海洋真菌的篩選及抑菌活性初探

王勇勇1，蒙春蕾1，蔡 爽1，黃 敏1，孟慶恒2*，孫建華2

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

實驗以白色念珠菌為對象，對從渤海灣不同站位分離獲得的55株海洋絲狀真菌進行了抗真菌活性菌株的篩選。從中篩選得到了BH431、BH515、BH531和BH09721 4株抑菌活性較高的菌株，并進一步對不同濃度發酵液的抑菌活性及代謝物性質進行了檢測。結果顯示，4株海洋真菌對野生型白色念珠菌SC5314均具有較強抑菌活性，其最小抑菌濃度分別為65 g/mL、19 g/mL、54 g/mL、23 g/mL；其中BH431和BH515菌株還顯示出對基因敲除型菌株RM1000的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為32 g/mL、39 g/mL。4株海洋真菌所產生的活性代謝物具有較好的酸堿適應性，活性物質分子質量＜6 000 u；其中BH431菌株的活性代謝物還具有良好的熱穩定性。

絲狀海洋真菌；白色念珠菌；抑菌活性；篩選

從海洋生物中尋找新型生物活性物質和高效菌株是近年來關注的熱點。已報道的天然代謝產物顯示出結構新穎、活性強，開發前景好的特性[1-2]。統計數據顯示，已報道的895個新型海洋微生物天然產物中有576個來源于海洋真菌[3]，這些代謝產物在抗腫瘤、抗病毒等生物活性方面有突出的表現[4-6]。盡管在海洋真菌抗菌活性的研究方面也取得了一定的進展，但多集中在抗細菌、抗放線菌活性的研究，抗真菌代謝物的研究還不多見[4]，尤其是有關抗白色念珠菌活性的研究更為少見[7-10]，而白色念珠菌不僅是一種典型的單細胞真菌，也是人畜共患的臨床上的條件病原真菌[11-12]。ZHANG Y等[13]從褐藻囊藻（Colpomenia sinuosa）分離到真菌Aspergillus niger EN-13、WEN L等[14]從臺灣紅樹林分離到真菌Paecilomyces sp.Tree1-7、HUANGZ等[15]從采自海南東寨港的紅樹林植物（Excoecaria agallocha）分離得到一株內生真菌Phomopsis sp.ZSU-H76、WANGW 等[16]從中國青島曬鹽場的海泥分離到耐鹽真菌Alternaria raphani及LIUF等[17]從采集自中國珠海的紅樹植物（Kandelia candel）中分離得到一株內生真菌Talaromyces sp.ZH-154，均對白色念珠菌有一定程度的抑制活性。因此，從海洋真菌中尋找新型抗白色念珠菌活性代謝物具有其特殊的意義[18]。

據此，本研究以從渤海灣不同站位分離獲得的55株海洋絲狀真菌為出發菌株，以白色念珠菌為對象，進行了抗真菌活性菌株的篩選，并對篩選出的活性菌株發酵液抗白色念珠菌的效果和代謝物的性質做了初步的分析，旨在為進一步開發利用海洋來源真菌的新型抗真菌藥物或先導化合物提供新的菌種來源和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋真菌：渤海灣不同站位點分離的55株絲狀真菌，由天津師范大學生命科學學院微生物實驗室分離保存。

靶標指示菌：白色念珠菌（Canidia albicans）野生型菌株SC5314和缺陷型菌株RM1000。

1.1.2 供試培養基

土豆培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：去皮土豆 200 g/L；葡萄糖20 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；瓊脂15 g/L；pH自然。

酵母培養基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母膏10 g/L；蛋白胨20 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂15 g/L；pH自然。

發酵培養基：去皮土豆200 g/L（浸汁）；葡萄糖20 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH自然。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）、MgSO4·7H2O（分析純）：天津市化學試劑一廠；無水乙醇、鹽酸：天津市化學試劑廠二廠；酵母膏、蛋白胨：北京澳博星生物技術有限責任公司；NaOH、瓊脂：天津市化學試劑廠三廠。

1.2 儀器與設備

3120血球計數板：國營上海醫用光學儀器廠；BL-220H電子天平：日本島津公司；E200顯微鏡：日本Nikon公司；YXQG02型電熱式滅菌鍋：山東新華醫療器械廠；Micro 200R離心機：廣州市華粵行儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱、G2X-9140MBE數顯鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；YX-DHS-35-420-60隔水式電熱恒溫培養箱：上海醫療器械七廠；UEOS-503型中空纖維膜組件、TP10-20超濾泵：天津膜天膜工程技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 靶標指示菌的培養

白色念珠菌：將保藏的白色念珠菌接入YPD斜面培養基，于26℃靜置培養活化3 d，活化2代后備用。

1.3.2 海洋真菌的培養

菌種的活化培養：將保藏的菌種接入PDA斜面培養基，于26℃下靜置培養5～7 d。

搖瓶培養：取經過活化的斜面菌種，用無菌水制備成1×106CFU/mL的孢子懸液，以培養基體積分數2%的孢子懸液接種于50 mL液體發酵培養基的三角瓶中，26℃、150 r/min搖瓶培養4 d。

1.3.3 海洋真菌發酵液的制備

將搖瓶培養好的發酵液經雙層濾紙真空抽濾，除去菌絲球等大體積懸浮物，再用孔徑為0.45μm的無菌微孔濾膜過濾，得到菌種發酵原液；發酵原液經UEOS-503型中空纖維膜組件（Mr=6 000 u）進行超濾，獲得分子質量大小不同的2組發酵液組分；發酵液及超濾液置于真空干燥箱制成干粉，為海洋真菌的粗提物干物質。

1.3.4 抗白色念珠菌活性菌株的篩選

菌株抑菌活性的初篩采用抑菌圈法：用無菌水將靶標菌制備成濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取0.1 mL置于預先倒好的平板上（Ф=9 cm），用無菌涂布棒涂勻，（培養條件如1.3.1）。取培養好的供試海洋真菌的平板，用打孔器（Ф= 8 mm）切取菌落生長均勻的部分，將切取的菌塊點植接種于涂有靶標指示菌的平板，每板2～3塊，菌塊間距為2 cm，24 h后觀察并測定抑菌圈大小。

篩選出的各菌株抑菌活性采用濾紙片法（將抑菌圈法的菌餅換為浸泡過發酵液的無菌濾紙片）對發酵液進行復篩，旨在復核確認能產生抑菌活性物質的活性菌株，排除菌體本身對靶標指示菌的影響。實驗設置3個重復，結果取平均值。

1.3.5 活性菌株發酵液抑菌活性的測定

取經活化2代的靶標菌制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，以不加靶標菌液作為對照（CK），發酵液按照2n進行梯度稀釋，按表1進行加樣混勻，于26℃培養12 h、24 h，在600 nm波長條件下測定吸光度值A600nm[19]。

1.3.6 活性代謝物性質的初步分析

發酵液不同組分的抑菌活性：分別檢測超濾后的大分子、小分子發酵液及發酵原液的抑菌活性。

pH穩定性：用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl溶液將活性菌株發酵液分別調成pH為4、5、6、7、8、9，分別檢測抑菌活性。

熱穩定性：將待測菌株發酵液經45℃、56℃、70℃、80℃、90℃處理24 h、121℃高溫滅菌20 min處理，以及發酵原液常溫處理24 h，檢測其抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 抗白色念珠菌海洋真菌的篩選

對55株渤海絲狀真菌抑菌活性檢測結果見表2，由表2可知，有21株海洋真菌對白色念珠菌具有較高的抑菌活性。濾紙片法復篩結果顯示，4株海洋真菌BH431、BH515、BH531、BH09721對野生型菌株SC5314有較強的抑菌活性，且菌株BH431和BH515對基因缺陷型菌株RM1000有較強的抑制作用，即確定對這4株海洋真菌做進一步的分析研究。

2.2 指示菌的抑菌效果

部分海洋真菌對指示菌的抑菌效果，結果見圖1。

由圖1可知，4株海洋真菌對白色念珠菌SC5314及RM1000均有抑制作用。

2.3 活性菌株發酵液的抑菌活性

2.3.1 活性菌株發酵液對SC5314的抑菌活性

初篩選取對白色念珠菌SC5314抑菌活性較強的菌株BH431、BH515、BH531、BH09721做進一步分析，檢測結果見圖2。

由圖2可以看出，菌株BH431的發酵液稀釋4倍時，培養12 h，吸光度值開始上升；而培養24 h，發酵液在稀釋2倍時吸光度值便開始上升，但明顯低于4倍稀釋液，因此，BH431菌株發酵液的最高稀釋倍數為2倍。菌株BH515發酵液稀釋度在1～8倍之間，培養12 h，吸光度值呈現平穩狀態，當發酵液稀釋16倍時，吸光度值開始上升，抑菌活性下降；而培養24 h，發酵液在稀釋8倍時吸光度值便開始上升，但明顯低于16倍稀釋液，表明BH515菌株發酵液的最高稀釋倍數為8倍。菌株BH531、BH09721的發酵液稀釋度在1～4倍之間時，培養12 h，吸光度值呈現平穩狀態，當發酵液稀釋8倍，二者的吸光度值均開始上升；而培養24 h，發酵液稀釋4倍吸光度值便開始上升，但明顯低于8倍稀釋液，因此，BH531、BH09721菌株發酵液的最高稀釋倍數為4倍。經換算，BH515、BH431、BH531、BH09721粗提物對SC5314的最小抑菌質量濃度分別為19μg/mL、65μg/mL、54μg/mL、23μg/mL。

2.3.2 活性菌株發酵液對RM1000的抑菌活性

對基因缺陷型白色念珠菌RM1000抑菌活性較強的菌株BH515和BH431做進一步分析，檢測結果見圖3。

由圖3可知，菌株BH515、BH431的發酵液稀釋度在1～4倍時，培養12 h，吸光度值呈現平穩狀態，當發酵液稀釋8倍，二者的吸光度值均開始上升；而培養24 h，發酵液稀釋4倍吸光度值便開始上升，但明顯低于8倍稀釋液。因此，BH515、BH431菌株發酵液的最高稀釋倍數均為4倍，經換算，BH515、BH431粗提物對RM1000的最小抑菌濃度分別為39μg/mL、32μg/mL。

2.4 活性菌株發酵液不同組分抑菌活性的分析

發酵液經UEOS-503型中空纖維膜組件（Mr=6 000 u）進行超濾后得到大分子組分（Mr＞6 000 u）和小分子組分（Mr＜6 000 u），分別進行抑菌活性檢測，結果見表3。

由表3可知，4株海洋真菌發酵液小分子組分和發酵原液抑菌活性較明顯，發酵液中截留的大分子物質抑菌活性顯著下降或幾乎沒有抑菌活性。結果表明，4株海洋真菌抑菌活性組分主要為發酵液小分子組分。

2.5 pH對活性菌株發酵液抑菌活性的影響

活性菌株發酵液分別調成pH值為4、5、6、7、8、9，分別檢測抑菌活性，結果見表4。

由表4可知，4株海洋真菌在設定的pH范圍內，其發酵液均表現出抑菌活性，這一結果顯示，pH值變化對發酵液的抑菌活性影響不大，表現出較好的酸堿適應性。且BH431菌株對SC5314的抑菌效果差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 發酵液的熱穩定性

將待測菌株發酵液經45℃、56℃、70℃、80℃、90℃處理24 h、121℃高溫滅菌20 min，以及發酵原液（常溫24 h），檢測其抑菌活性，結果見表5。

由表5可知，菌株BH431的發酵液對白色念珠菌的抑菌活性受溫度影響差異不顯著（P＞0.05），具有較好的熱穩定性；菌株BH09721、BH531、BH515的發酵液具有一定的耐熱性，但經80℃以上高溫處理喪失了抑菌活性，即失活。

3 結論

本研究從渤海灣水域分離獲得的55株海洋絲狀真菌中篩選出抗白色念珠菌活性顯著的菌株BH515、BH431、BH531、BH09721，并對其進行了初步的分析研究。其中海洋真菌BH431和BH515不僅對野生型白色念珠菌SC5314有抑制作用，對基因缺陷型菌株RM1000也有較強的抑制作用，已有報道表明，菌株RM1000喪失了合成組氨酸的功能[20]，基因類型為ura3：：imm434/ura3：：imm434 iro1/ iro1：：imm434 his1：：hisG/his1：：hisG[21-22]，而菌株SC5314能正常合成組氨酸，其具體作用機制有待進一步研究。已有報道顯示，菌株BH431還具有較強的殺線活性[23]和抑大腸桿菌活性[24]的功能，且其菌種發酵液具有較廣泛的酸堿適應范圍及耐高溫特性，顯示出菌株BH431相對廣泛的生物活性，具有可觀的研究前景。

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Screening of anti-Canidia albicans marine fungi and their antifungl activity

WANGYongyong1,MENG Chunlei1,CAIShuang1,HUANG Min1,MENGQingheng2*,SUN Jianhua2

(1.College of Life Science,Tianjin NormalUniversity,Tianjin 300387,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin NormalUniversity,Tianjin 300387,China)

Using Candida albicans as the target strain,antifungal strains were screened from fifty-five marine-derived filamentous isolated from differentsites in Bohai Bay.Four strains of BH431,BH515,BH531 and BH09721 which had higher anti-C.albicans activity were screened,and the antifungal activity of the fermentation broth and the character ofmetabolite were preliminary tested.The results showed that the four strains had higher antifungalactivities to the wild type C.albicans SC5314.Their minimalinhibitory concentration(MIC)was 65 g/ml,19 g/ml,54 g/mland 23 g/ml, respectively.Whereas,strains BH431 and BH515 possessed antifungalactivity to the knockoutstrain RM1000 with MIC 32 g/mland 39 g/ml.Moreover,their active metabolites also showed adaptability in a wide range of pH.The ultrafiltration results suggested that the molecular mass(Mr)was less than 6 000 u.Extensively,the active metabolite of BH431 strain showed an excellentthermostability.

marine-derived filamentous fungi;Canidia albicans;antifungalactivity;screening

Q939.9

A

0254-5071（2015）02-0055-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.013

2014-12-12

國家自然科學基金資助項目（31272019）

王勇勇（1987-），女，碩士研究生，研究方向為應用微生物。

*通訊作者：孟慶恒（1963-），男，副教授，碩士，研究方向為應用微生物。