桶裝純凈水的微生物檢測與鑒定

李作美，李 娜，王曉云，于澤權

（蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

桶裝純凈水的微生物檢測與鑒定

李作美，李 娜，王曉云，于澤權

（蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

選用成品桶裝純凈水為研究對象，成品分別在下線6 h、12 h、24 h、48 h、96 h后進行菌落總數檢測，并對其微生物類別進行鑒定，目的是對桶裝純凈水中的微生物有針對性地進行預防和控制。結果表明，成品下線6 h后，檢測樣品時幾乎沒有微生物的存在，然而隨著時間的延長，菌落總數明顯的增多。分別對不同的菌落進行分離、純化并進行鑒別，結果顯示有細菌（主要是大腸桿菌）和真菌。

桶裝純凈水；微生物；菌落總數；大腸桿菌

快節奏的現代生活使得桶裝純凈水走進千家萬戶，其已經成為人們日常生活中一種方便快捷的飲用水資源。但由于質量參差不齊，純凈水是否真的“純凈”，存在著質疑[1]。

目前我國的桶裝純凈水市場抽檢合格率低，主要表現在純凈水中微生物數量超標，這在一定程度上給消費者的健康帶來危害[2]。由于桶裝純凈水在生產、運輸和飲用過程中稍有不慎就容易引起污染，其衛生安全值得人們去關注。本實驗以某公司生產的桶裝純凈水為研究對象，對水樣中的微生物進行檢測和分離鑒定，旨在為今后桶裝純凈水的生產、運輸及飲用中制定更加安全的防控措施。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某公司生產的桶裝純凈水。

蛋白胨和酵母浸膏（生化純），氯化鈉、葡萄糖、乳糖、磷酸二氫鉀、瓊脂、乙醇、碘、草酸銨、碘化鉀等（分析純）：南京博岸生物科技有限公司；溴甲酚紫、伊紅、結晶紫、美藍、沙黃等：南京匯鑫化學試劑有限公司。

細菌培養基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）、葡萄糖蛋白胨瓊脂水培養基、乳糖膽鹽發酵培養基、乳糖發酵培養基、伊紅美蘭（eosinmethylene blue，EMB）培養基[3-7]。

1.2 儀器與設備

DHP-9012恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；YM-50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養箱：上海三發科學儀器有限公司；B203LED光學顯微鏡：重慶奧特關學儀器有限公司；CX-204凈化工作臺：久禾凈化技術有限公司；FA1604電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水樣的稀釋[8]

在裝有225 mL蒸餾水的滅菌三角瓶內注入25 mL樣品，混合均勻，得到10-1的樣品溶液。在裝有9 mL蒸餾水的滅菌試管中加入1 mL稀釋10倍的樣品溶液，混合均勻，得到10-2的樣品溶液，同樣方法制成10-3的樣品溶液。

分別吸取10-1、10-2、10-3樣品1 mL于無菌平皿內，每個稀釋梯度做2個平皿。吸取1mL無菌水加入無菌平皿作空白對照。

1.3.2 菌落總數的測定[9-10]

在適合計數范圍內若唯有一個稀釋度平板菌落數，則計算兩平板菌落數平均值，再乘以相應稀釋倍數，獲得每毫升樣本中菌落總數；在適合計數范圍內有兩個連續稀釋度的平板菌落數，其計算公式：

式中：N為樣品中菌落數，CFU/mL；∑C為平板菌落數之和；n1為第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數；n2為第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

若是每一個稀釋度平板菌落數都超過300CFU，就計數稀釋度最高的平板，其余平板記“多不可計”，以平均菌落數乘以最高稀釋倍數作結果。若是每一個稀釋度平板菌落數都低于30，就計算稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數獲得結果。若是每一個稀釋度（包含樣本原液）平板都沒有菌落生長，就以小于1乘以最低稀釋倍數記錄。若是每一個稀釋度的平均菌落數均不在30～300范圍內，就計算最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數。

1.3.3 大腸菌群的測定

乳糖膽鹽發酵試驗[11]：在乳糖膽鹽發酵管內接種待測樣品，每一個稀釋度接種三管，37℃培育24h，若乳糖膽鹽發酵管均沒有產氣現象就記錄大腸菌群陰性；若產氣，即試管中倒置的德漢氏小管中有氣泡產生，則繼續試驗。

伊紅美藍瓊脂平板分離[11]：在EMB培養基平板上分別接種產氣產酸的培養物，37℃培養18～24h。篩選吻合如下特點：深紫黑色有金屬光澤、紫黑色不帶或略帶金屬光澤、淡紫紅色中央顏色較深的菌落，涂片。

革蘭氏染色[12]：制片，用結晶紫染色液染色1min后用蒸餾水清洗。涂片烘干用革蘭氏碘液作用1min用蒸餾水清洗。涂片烘干用體積分數95%的乙醇脫色約30s，蒸餾水洗。涂片烘干用復染色液染色1min水洗烘干。顯微鏡觀測，染色結果呈紫色的是革蘭氏陽性菌，呈紅色的是革蘭氏陰性菌。

復發酵實驗[11]：樣本為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另外一部分，接種到乳糖發酵管，每管能夠接種來自同一初發酵管同類型菌落1～3個，37℃培養24h。乳糖發酵管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，可記錄為大腸菌群陽性。

2 結果與分析

2.1 細菌菌落總數的測定[13]

2.1.1 成品下線6h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線6h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每一個濃度稀釋梯度做2個平行實驗，即表1中用序號1和2所表示。采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基制成平板，放置在37℃培養箱中培養24h，結果見表1。由表1可知，培養基內無菌落生長，各梯度平均菌落數為0，平均菌落總數＜1×10-3CFU/mL。

2.1.2 成品下線12h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線12h后，對純凈水進行取樣稀釋并培養，在37℃培養箱中培養24h，結果見表2。由表2可知，培養基中存在較少菌落，10-1樣品的平均菌落數為40～50CFU/mL，其他稀釋度平均菌落數為0，樣品中平均菌落總數為45CFU/mL。

2.1.3 成品下線24h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線24h后，從同一批次的純凈水中取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，采用細菌培養基制成平板，放置在37℃培養箱中培養24h，結果見表3。由表3可知，培養基中菌落數量明顯增加，10-1樣品平均菌落數33CFU/mL，10-2樣本平均菌落數13CFU/mL，10-3樣本平均菌落數6CFU/mL，樣品平均菌落總數335CFU/mL。

2.1.4 成品下線48 h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線48 h后，從同一批次的純凈水中取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，在37℃培養箱中培養24 h，結果見表4。由表4可知，經過培養后觀察培養基上菌落較多，10-1樣本平均菌落數222 CFU/mL，10-2樣本平均菌落數89 CFU/mL，10-3樣本平均菌落數24 CFU/mL，樣品平均菌落總數225 CFU/mL。

2.1.5 成品下線96 h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線96 h后，取樣稀釋并培養，在37℃培養基中培養24 h，結果見表5。由表5可知，培養基長滿了菌落，10-1樣本菌落數多不可計，10-2樣本平均菌落數220 CFU/mL，10-3樣本平均菌落數33 CFU/mL，樣品平均菌落總數2.5×104CFU/mL。

2.2 真菌菌落總數的測定

2.2.1 成品下線6 h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線6 h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，分別配制酵母菌培養基和PDA培養基來培養酵母和霉菌，經過一段時間的培養后觀察培養皿內無酵母菌及霉菌的生長，樣品霉菌平均菌落總數＜1×10-3CFU/mL，酵母平均菌落總數＜1×10-3CFU/mL，結果見表6。

2.2.2 成品下線12 h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線12 h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，經過培養后觀察培養皿中有少量霉菌及酵母存在，10-1樣本霉菌平均數為3 CFU/mL，酵母菌平均數為5 CFU/mL，其他稀釋度無菌落生長。樣品霉菌平均菌落總數30 CFU/mL，酵母平均菌落總數45 CFU/mL，結果見表7。

2.2.3 成品下線24 h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線24 h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，從表8可以看出，霉菌及酵母菌數量明顯增加，10-1樣本霉菌平均菌落數56 CFU/mL，酵母菌平均菌落數27 CFU/mL。10-2樣本霉菌菌落數11 CFU/mL，酵母菌平均菌落數6 CFU/mL。10-3樣本霉菌菌落數5 CFU/mL，酵母菌平均菌落數3 CFU/mL。樣本霉菌平均菌落總數560 CFU/mL，酵母平均菌落總數270 CFU/mL。

2.2.4 成品下線48 h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線48 h后取樣培養，霉菌及酵母菌數量增加較多，10-1樣本霉菌平均菌落數107 CFU/mL，酵母菌平均菌落數135 CFU/mL。10-2樣本霉菌菌落數59 CFU/mL，酵母菌平均菌落數39 CFU/mL。10-3樣本霉菌菌落數27 CFU/mL，酵母菌平均菌落數15 CFU/mL。樣本霉菌平均菌落總數1×103CFU/mL，酵母菌平均菌落總數1.3×102CFU/mL，結果見表9。

2.2.5 成品下線96 h后桶裝純凈水取樣培養

成品下線96 h后，取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，經過培養后觀察培養皿中的菌落數。10-1樣本霉菌、酵母菌平均菌落數多不可計，10-2樣本霉菌平均菌落數163 CFU/mL，酵母菌平均菌落數166 CFU/mL，10-3樣本霉菌平均菌落數46 CFU/mL，酵母菌平均菌落數79 CFU/mL。樣品霉菌平均菌落總數4.4×104CFU/mL，酵母菌平均菌落總數7.9×104CFU/mL，結果見表10。

2.3 大腸菌群測定

2.3.1 乳糖膽鹽發酵試驗

成品下線96 h后取樣，置乳糖膽鹽發酵管內培養，37℃培養24 h，觀察乳糖膽鹽發酵10-1-1、10-1-2、10-1-3、10-2-2、10-2-3和10-3-2號試管中產氣，其余的不產氣的記為大腸菌群陰性菌。結果見表11。

2.3.2 伊紅美藍瓊脂平板試驗

在乳糖膽鹽發酵管中，選取德漢氏小管產氣的試管，進行取樣稀釋，然后接種到EMB培養基中，涂布均勻，37℃培養24 h。觀察到培養基的表面長滿了帶有金屬光澤的紫色菌落。

2.3.3 乳糖發酵試驗

由于乳糖發酵試驗不是純菌發酵而是樣品發酵，所以初發酵陽性并不能代表大腸菌群為陽性，要進行驗證實驗。挑選合適的菌落進行革蘭氏染色，同時取相同部位的菌落置于乳糖發酵管37℃培養24 h，結果見表12。

由表12可知，10-1-2、10-2-2和10-2-3號試管中存在大腸菌群。對照MPN檢索表可得，樣品中大腸菌群1 100 CFU/100 mL。95%可信限下限300 CFU/100 mL，上限3 600 CFU/100 mL。

3 結論

根據GB4789—2010《食品微生物學檢驗》和GB17324—2003《瓶（桶）裝飲用純凈水衛生標準》，采用菌落計數及多管發酵等。對某公司生產的桶裝純凈水進行微生物檢測鑒定[14-16]。樣品采集選擇的時間分別為成品下線后6 h、12 h、24 h、48 h和96 h。在純凈水生產工藝中有臭氧殺菌的工序，殘留的臭氧有殺菌的功效，加上生產環節符合衛生要求，因此成品下線6 h檢測樣品時幾乎沒有微生物的存在。

實驗結果表明，桶裝純凈水隨著存放時間的延長，微生物的菌落總數也隨之增多，成品下線12 h后，細菌、霉菌、酵母菌菌落總數及大腸菌群均超過國標要求。分析造成這種現象的原因，有可能是3種情況：一是桶裝純凈水在生產過程中殺菌不徹底；二是在運輸銷售過程中的擠壓、碰撞造成桶蓋松動；三是開啟飲用的過程中受到有菌的飲水機的影響。針對這幾種微生物污染的原因，首先應從生產環節加以控制，嚴格要求從業人員進行無菌操作，制定良好的操作規范，確定關鍵控制點。對制水車間和灌裝車間進行紫外線殺菌，對生產管道和貯水容器、空桶及桶蓋進行臭氧消毒。其次在運輸銷售過程中，要檢查桶蓋的密封性是否完好，嚴防過分的擠壓、劇烈的碰撞導致桶蓋松動。最后在開啟飲用前，要對飲水機進行清洗消毒，防止雜菌污染。總之，解決好桶裝純凈水在生產、運輸和飲用過程中的微生物污染問題，是提高桶裝純凈水質量的有效途徑。

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Detection and identification of microorganisms in bottled purified water

LIZuomei,LINa,WANGXiaoyun,YUZequan

(Departmentof Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233000,China)

The totalbacterialcountwas detected and microorganism categories were identified in bottled purified water afteronline production for6 h, 12 h,24 h,48 h,96 h.The main detection purpose was to prevent and control microorganism in pure water process.Test results showed that total bacterial count of samples after online production for 6 h almost had no microorganisms,however,with the extension of time,the totalnumber of colonies increased obviously.Afterseparation,purification and identification ofdifferentcolonies,the results showed thatbacteria(mainly Escherichia coli)and fungiwere founded.

bottled purified water;microorganism;totalbacterialcount;Escherichia coli

TS201.3

A

0254-5071（2015）02-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.036

2014-09-02

蚌埠學院工程研究中心項目（BBXYGC2013C05）；國家級大學生創新創業項目（201411305016）

李作美（1975-），講師，碩士，研究方向為食品生物技術。