基于離子色譜技術(shù)快速定量乳制品中亞硝酸鹽的含量

顏 琪，顧春華，李京寧

（1.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)中心，寧夏 銀川 750000）

基于離子色譜技術(shù)快速定量乳制品中亞硝酸鹽的含量

顏 琪1，顧春華2，李京寧1

（1.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)中心，寧夏 銀川 750000）

本研究旨在建立離子色譜法快速測(cè)定乳制品中亞硝酸鹽含量的分析方法。樣品采用0.005 mmol/L NaOH提取，1∶1的乙腈-3%乙酸溶液作為蛋白沉淀劑，以1.8 mmol/L NaHCO3-和1.2 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速為1.2 mL/min，分析柱為InoPacAS14，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明，亞硝酸鹽的檢出限為0.04 mg/kg，加標(biāo)回收率為96.8%～99.4%，與國(guó)標(biāo)GB/T 5009.33—2010中檢測(cè)方法比較，相對(duì)偏差＜1%。方法簡(jiǎn)便，快速，用于乳制品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定結(jié)果滿意。

離子色譜法；亞硝酸鹽；乳制品；定量檢測(cè)

乳制品中含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、多種維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)要素[1]。亞硝酸鹽在細(xì)菌的作用下可變成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝酸胺，亞硝酸鹽含量過高會(huì)引起高鐵蛋白癥[2-3]。目前各類品種繁多的乳制品不斷涌入市，隨著人們生活水平的提高，越來越多的家庭把乳制品當(dāng)作每日不可缺少的必需品[4]。因此，牛奶質(zhì)量的好壞直接影響到人們的身體健康。隨著人們對(duì)食品安全認(rèn)識(shí)的提高，乳制品中亞硝酸鹽的含量日漸成為人們關(guān)注的對(duì)象，乳制品中亞硝酸鹽含量高低是衡量乳制品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[5-6]。因此監(jiān)測(cè)乳制品中亞硝酸鹽含量有著極為重要的意義。

目前，乳制品中亞硝酸鹽主要依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》，采用比色法進(jìn)行定量[7]。但實(shí)踐證明，此法存在操作冗長(zhǎng)費(fèi)時(shí)，需用多種化學(xué)試劑，干擾大，靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性較差等缺點(diǎn)[8]。離子色譜法是重要的現(xiàn)代無機(jī)陰離子分析新技術(shù)，具有快速、靈敏、選擇性好、前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9]。本研究采用離子色譜法測(cè)定乳制品中亞硝酸鹽的含量，通過研究其分離提取的最佳條件及色譜分析參數(shù)，旨在建立一種準(zhǔn)確、快速測(cè)定乳制品中亞硝酸鹽含量的方法，適用于大批量檢測(cè)工作，進(jìn)一步為亞硝酸鹽的測(cè)定研究提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抽取3種市售乳制品（牛奶、酸奶、奶粉，各20個(gè)樣品）；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；乙腈、乙酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉均為色譜純：天津市康科德科技有限公司；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 mg/L）：北京易萊希諾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-2000型離子色譜儀及分析系統(tǒng)（內(nèi)置式的數(shù)字化的電導(dǎo)檢測(cè)器SRS自動(dòng)再生微膜抑制器）、Chromeleon色譜工作站：美國(guó)戴安公司；InoPacAS14分離柱：戴安中國(guó)有限公司；美國(guó)MILLIPORE（密理博）純水機(jī)：廣州哲天科學(xué)儀器有限公司；ME梅特勒分析天平：武漢宏錦科技有限公司；H-1850R高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；B220恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；0.45μm微孔濾膜：天津富集科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備及分析

稱取經(jīng)混勻的液體乳5.00 g或乳粉1.00 g（精確至0.01 g）于25 mL具塞比色管中，加入10 mL提取劑，水浴加熱，取出后冷卻至室溫。加入10 mL蛋白沉淀劑，用去離子水定容至刻度，搖勻，靜置10 min。在常溫下離心，取上清液，以0.45μm濾膜過濾，備用。以保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量，在相同色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液經(jīng)離子色譜分析。

1.3.2 亞硝酸鹽分析離子色譜條件

色譜柱：陰離子分離柱Dionex AS14柱（4 mm×250 mm）及保護(hù)柱IonPac AS14（4 mm×50 mm）；流動(dòng)相：淋洗液；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；抑制器：陰離子抑制器；進(jìn)樣量：25μL。

1.3.3 計(jì)算公式

試樣中亞硝酸鹽（以NO2-計(jì)）含量按下公式計(jì)算：

式中：X為試樣中亞硝酸鹽的含量，mg/kg；C為試樣中實(shí)測(cè)亞硝酸鹽的質(zhì)量濃度，mg/L；V為試樣溶液體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

式中：X為試樣中實(shí)測(cè)亞硝酸鹽的含量，mg/kg；A為試樣所含亞硝酸鹽的含量，mg/kg；B為加入標(biāo)品量，mg/kg。

1.3.4 亞硝酸鹽分離提取及色譜分析條件的優(yōu)化

（1）分離提取條件的優(yōu)化

提取劑的種類、提取溫度及時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的提取效果有很大影響，為確保準(zhǔn)確的定量結(jié)果，本研究對(duì)亞硝酸鹽的分離提取主要從以下幾個(gè)方面展開：提取劑種類的選擇、提取溫度及時(shí)間的優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)的分離提取工藝。以亞硝酸鹽的回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)查閱資料，選用的提取劑為超純水及0.005 mmol/L NaOH[10]，并且采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)U9（96），以提取溫度、時(shí)間作為分離提取關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化工藝，因素與水平見表1。

（2）蛋白沉淀劑的選擇

乳制品中含有大量的蛋白質(zhì)，會(huì)污染分離柱，縮短分離柱的使用壽命，使柱效降低，因此在前處理過程中必須除去蛋白[11]。GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》比色法中通常使用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白，然而此法在沉淀蛋白的同時(shí)卻在溶液中引入了鋅、鐵等金屬離子，其進(jìn)入色譜柱中會(huì)發(fā)生殘留，不但干擾分離效果，且會(huì)損壞色譜柱[12]。本試驗(yàn)查閱資料擬選用的蛋白沉淀劑種類[13]見表2。

（3）分離參數(shù)的優(yōu)化

以亞硝酸鹽的回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選出最佳的離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間，離心試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表3。

（4）離子色譜分析參數(shù)的優(yōu)化

乳制品的基體組成復(fù)雜，會(huì)存在雜質(zhì)與亞硝酸鹽的保留時(shí)間接近的問題，干擾目標(biāo)物的測(cè)定[14]。而物質(zhì)的保留時(shí)間受淋洗液的種類、濃度及流速的影響，是影響分析效果的主效因素，因此應(yīng)該在保證檢測(cè)靈敏度的前提下，通過優(yōu)化流速、淋洗液種類及濃度，從而調(diào)整樣品保留時(shí)間，避免分離過程中雜質(zhì)的干擾[15-16]。

經(jīng)查閱資料，篩選出選擇1.8 mmol/LNaHCO3+1.2mmol/L Na2CO3作為淋洗液，且流速為1.2 mL/min[17-18]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2010處理數(shù)據(jù)，使用IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響

提取劑對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響見圖1。由圖1可知，用0.005 mmol/L的NaOH溶液和超純水分別對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行提取時(shí)，前者的效果更好，對(duì)亞硝酸鹽的回收率高，這是因?yàn)閬喯跛猁}（NO2-）在弱堿性條件下更能穩(wěn)定地存在[19]，因此，本試驗(yàn)選擇0.005 mmol/L的NaOH溶液作為提取劑。

2.2 提取時(shí)間及溫度對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響

對(duì)亞硝酸鹽分離提取工藝關(guān)鍵參數(shù)，即提取時(shí)間及溫度的優(yōu)化結(jié)果見表4。

由表4可知，第6組試驗(yàn)的回收率指標(biāo)值99.3%最大。通過IBMSPSS Statistics 19軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出顯著性檢驗(yàn)中R2=0.998，F(xiàn)＞F0.01，說明回歸方程高度顯著。根據(jù)回歸方程各個(gè)系數(shù)絕對(duì)值的大小可判斷兩個(gè)因素對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響順序?yàn)闇囟龋緯r(shí)間。通過Excel規(guī)劃求解，得出最優(yōu)搭配及最佳試驗(yàn)指標(biāo)。亞硝酸鹽分離提取最佳參數(shù)為提取時(shí)間30 min，提取溫度60℃。按以上獲得的最優(yōu)分離工藝參數(shù)提取亞硝酸鹽，3次回收率平均值為99.4%。

2.3 蛋白沉淀劑對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響

蛋白沉淀劑對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響見圖2。由圖2可知，使用乙腈-3%乙酸混合溶液提取亞硝酸鹽時(shí)，沉淀蛋白效果最為理想。這可能是由于兩種有機(jī)溶劑的組合能更好地沉淀性質(zhì)不同的蛋白雜質(zhì)[20]。比較乙腈與3%乙酸在不同體積比條件下對(duì)蛋白的沉淀效果及對(duì)亞硝酸鹽（NO2-）回收率的影響，結(jié)果見表5。

從表5中可以看出，隨著乙腈在混合溶液中比例的增加，沉淀蛋白的效果越來越好，且對(duì)亞硝酸鹽的回收率也逐漸升高，當(dāng)乙腈與3%乙酸體積比為5∶5時(shí)，沉淀蛋白的效果滿意且能兼顧良好的回收率。隨著乙腈體積的繼續(xù)增加，沉淀蛋白的效果及對(duì)亞硝酸鹽的回收率均趨于下降趨勢(shì)。因此，本試驗(yàn)選擇1∶1的乙腈-3%乙酸溶液體積比作為蛋白沉淀劑，沉淀效果較好，省去過小柱步驟，節(jié)約成本，快速有效。

2.4 離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽回收率的影響

根據(jù)擬定的離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，所得結(jié)果見表6。

由表6可知，在離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min時(shí)，延長(zhǎng)離心時(shí)間，亞硝酸鹽的回收率越高，離心效果越好；在離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min時(shí)離心效果整體均高于4 000 r/min離心時(shí)的效果，這說明，離心轉(zhuǎn)速越高，雜質(zhì)沉降的效果相對(duì)越好。當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，離心時(shí)間為20 min時(shí)，亞硝酸鹽回收率最高，達(dá)99.2%，并且上清液澄清，與雜質(zhì)得到了很好的分離，便于進(jìn)行下一步濾膜過濾。

2.5 離子色譜條件的選擇

選擇1.8 mmol/L NaHCO3+1.2 mmol/L Na2CO3作為淋洗液，且流速為1.2 mL/min時(shí)，以電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)，洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)，得到的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，結(jié)果見圖3。由圖3可知，亞硝酸鹽出峰時(shí)間為4.667 min。樣品以相同色譜條件進(jìn)樣，亞硝酸鹽與乳制品中的雜質(zhì)得到了很好的分離，峰形完整，達(dá)到了最佳的分離狀態(tài)，乳制品中亞硝酸鹽的出峰時(shí)間為4.643 min，結(jié)果見圖4。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系和檢出限

將亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)備工作溶液，測(cè)得亞硝酸鹽在不同質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的峰面積。峰面積A與質(zhì)量濃度C的線性方程為C=0.593 8+0.0137 6A，相關(guān)系數(shù)R為0.999 8。以信號(hào)噪聲的3倍計(jì)算檢出限，亞硝酸鹽的檢出限為0.04 mg/kg。GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》中檢測(cè)方法的檢出限為0.2 mg/kg，檢出限本法低于國(guó)標(biāo)5倍。

2.6.2 回收率試驗(yàn)

依次對(duì)已知含有一定亞硝酸鹽含量的4種乳制品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，計(jì)算其平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表7。

表7可以看出，亞硝酸鹽的回收率在96.8%～99.4%之間，本方法測(cè)定亞硝酸鹽的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.5%。由此表明，本試驗(yàn)方法具有良好的準(zhǔn)確度，可以達(dá)到定量分析的要求。

2.7 方法對(duì)比試驗(yàn)

隨機(jī)選擇乳樣45個(gè)，分別按GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》中的比色法和離子色譜法檢測(cè)樣品，進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，亞硝酸鹽含量測(cè)定結(jié)果取平均值，結(jié)果見表8。

表8結(jié)果表明，兩種方法所測(cè)的亞硝酸鹽結(jié)果基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.12，P＞0.05），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1%。因此，離子色譜法具備替代比色法檢測(cè)乳制品中亞硝酸鹽含量的可能性。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)等統(tǒng)計(jì)方法獲得亞硝酸鹽分離提取及色譜分析的最佳工藝參數(shù)：提取劑為0.005 mmol/L的NaOH溶液，提取時(shí)間為30 min，提取溫度為60℃，蛋白沉淀劑為體積比1∶1的乙腈-3%乙酸溶液，離心轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，離心時(shí)間為20 min，分離液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，以1.8 mmol/L NaHCO3+1.2 mmol/L Na2CO3作為淋洗液，流速為1.2 mL/min進(jìn)行色譜分析，亞硝酸鹽的回收率達(dá)99.4%。

離子色譜法亞硝酸鹽的檢出限為0.04 mg/kg，加標(biāo)回收率為96.8%～99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.5%，對(duì)乳制品中亞硝酸鹽檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法。該方法前處理簡(jiǎn)便，靈敏度、準(zhǔn)確性高，檢測(cè)限低，能夠滿足液態(tài)乳和乳粉中的亞硝酸鹽的檢測(cè)要求。

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Nitrite determination of in dairy products by ion chromatography technique

YANQi1,GU Chunhua2,LIJingning1

(1.Gansu Instiute of Food Inspection and Research,Lanzhou 730030,China; 2.Food Testing Center of the Ningxia HuiAutonomous Region,Yinchuan 750000,China)

An analytical method was developed for nitrite determination in dairy products using ion chromatography.Samples were extracted with 0.005 mmol/L NaOH,and protein was precipitated by the mixture of acetonitrile and 3%acetic acid solution with ratio of 1∶1.The eluent was composed of 1.8 mmol/L NaHCO3-and 1.2 mmol/L Na2CO3,and the flow rate was 1.2 ml/min.The analysis was performed on Dionex AS14 separation column,and the conductivity detectorwas used for detection.Results showed thatthe detection limitwas 0.04 mg/kg fornitrite.The recoveries tested by the standard additions method were in the range of 96.8%to 99.4%.The results was compared with the results of GB/T 5009.33—2010,the relative deviation was less than 1%.The method was simple,time-saving,and suitable forthe determination ofnitrite in dairy products.

ion chromatography;nitrite;dairy product;quantitative determination

O658

A

0254-5071（2015）02-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.034

2014-12-02

顏 琪（1964-），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量和安全分析。