谷朊粉酶解物的制備及其ACE抑制肽的分離鑒定

王章存，王 穎，曹 芹，王許東，安廣杰，趙學偉

（1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.鄭州新威營養技術有限公司，河南 鄭州 450000）

谷朊粉酶解物的制備及其ACE抑制肽的分離鑒定

王章存1，王 穎1，曹 芹1，王許東2，安廣杰1，趙學偉1

（1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.鄭州新威營養技術有限公司，河南 鄭州 450000）

以谷朊粉為原料，以血管緊張素轉換酶（ACE）抑制率為指標，比較4種蛋白酶的酶解效果。采用超濾、葡聚糖凝膠色譜、反相高效液相色譜（RP-HPLC）的方法分離純化ACE抑制肽并用電噴霧飛行時間質譜聯用(ESI-TOF-MS)鑒定其結構。結果表明：堿性蛋白酶酶解3 h的谷朊粉酶解物具有較高的ACE抑制活性；超濾后，分子質量Mr＜1 ku的組分具有較高的ACE抑制率；分離純化后得到小肽的ACE抑制率高達（81.03±1.20）%；由ESI-TOF-MS質譜圖得出該小肽的m/z為630.89，氨基酸序列為Trp-Phe-Gln-Pro（WFQP）。

谷朊粉；酶解；血管緊張素轉換酶抑制肽；分離；結構鑒定

近年來，高血壓患病率持續增長，對人類健康帶來巨大威脅[1]。引起高血壓的原因很多，其中體內血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的調節作用被認為是最主要的原因之一。ACE對調節血壓的作用變現為：一方面通過促進不具有催化活性血管緊張素Ⅰ轉化為具有促進血管收縮作用的血管緊張素II；另一方面通過降解具有舒張血管緊張作用舒緩肌肽使其失活[2]。

自1965年由FERREIRA S H等[3]首次從南美洲蝮蛇（Bothrops jararaca）的毒液中發現ACE抑制肽以來，降血壓肽的研究引起了人們極大的興趣。近年來，通過酶解天然蛋白制備具有ACE抑制活性的短肽引起了廣泛關注，這些肽不僅在生物體內表現出較強的降血壓活性，而且具有使用安全、無副作用、易消化吸收、降壓效果溫和專一等諸多優點，應用前景廣闊。大量的食源性ACE抑制肽已被分離出來，如魚類蛋白[4]、陸生動物蛋白[5]、植物蛋白[6]等。我國具有豐富的小麥資源，谷朊粉是小麥淀粉生產的副產物，其蛋白質含量高達75%以上，是物美價廉的食源性蛋白源[7]。本研究以谷朊粉為原料，在比較幾種不同蛋白酶水解產物的ACE抑制活性的基礎上，確定以堿性蛋白酶水解谷朊粉，將酶解物經分離、純化得到谷朊粉ACE抑制肽并對其中ACE抑制率最高的組分進行了結構鑒定和分析。旨在實現谷朊粉的應用，為進一步研究ACE抑制肽的構效關系提供了新素材。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷朊粉：河南省蓮花味精有限公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復合酶：丹麥Novozymes公司；血管緊張素轉換酶（ACE，0.1 UN/mL）、馬尿酰-組胺酰-亮氨酸（hippuryl-His-leu，HHL）：美國Sigma公司；Sephadex G-15：美國Pharmacia公司；其他化學品及試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HH-601恒溫水浴鍋：江蘇金壇市科析儀器有限公司；UV8100B紫外可見分光光度計：北京LabTech儀器有限公司；AgilentZorbax 300SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）、Agilent Proshell300SB-C18色譜柱（2.1 mm×75 mm，5μm）：美國安捷倫科技公司；OAPMP220超濾裝置：美國Pall公司；反相高效液相色譜儀：美國Waters公司；TSQ Quantum液質聯用儀（LC-MS）：美國熱電科技公司。

1.3 方法

1.3.1 谷朊粉酶解物的制備

將谷朊粉以30 mg/mL的質量濃度溶解在蒸餾水中，分別用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解4 h。以0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h和4.0 h的間隔取出酶解物，沸水浴中加熱5 min滅酶。然后將試樣以3 000 r/min離心15 min，上清液凍干后待用。

1.3.2 ACE抑制率的體外測定

ACE抑制活性參考反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）法測定[8-9]。取凍干后的谷朊粉酶解物（2.5 mg/mL）溶解于硼酸鹽緩沖溶液中（pH 8.3，0.1 mol/L，其中含0.3 mol/L NaCl），取10μL樣品溶液加入10μLACE（溶于上述相同緩沖液）于37℃預熱10 min，加入50μL 5 mmol/L的HHL（溶于相同緩沖溶液），37℃反應30 min后加入100μL 1 mol/L HCl溶液終止反應；冷卻至室溫后，取10μL反應產物進樣，通過RP-HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量，同時做樣品空白和對照。

式中：c為樣品不參與反應色譜峰面積；b為ACE不參加反應空白峰面積；a為ACE和樣品都參與反應色譜峰面積。

色譜條件：色譜柱Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×250 mm）；紫外檢測器波長228 nm；流動相A 50%乙腈，流動相B 50%超純水（含0.1%三氟乙酸）；流速1.0 mL/min，進樣量20μL，柱溫25℃，檢測時間20 min。

1.3.3 ACE抑制肽的分離純化

（1）采用PALL MinimateTM切向流超濾系統，將ACE抑制率較高的谷朊粉酶解物通過截留分子量（molecular weightcut-off，MWCO）為1 ku、2 ku和3 ku的超濾膜（Omega膜，有效過濾面積50 cm2）。超濾后的水解物各組分凍干，做ACE抑制率的體外測定。

（2）將超濾后ACE抑制率高的組分以10 mg/mL的質量濃度再次溶解在蒸餾水中。用Sephadex G-15凝膠過濾色譜柱（10 mm×600 mm）進一步分離。洗脫液為蒸餾水，洗脫流量0.5 mL/min，檢測收集液波長280 nm處的吸光度值。將所需的峰收集并凍干，用于ACE抑制率的體外測定。

（3）將凝膠過濾后顯示最高ACE抑制率的組分用Angilent Zorbax 300SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）進一步純化。柱子用含有0.1%甲酸（formic acid，FA）的乙腈（5%～50%）線性梯度洗脫，流速為1.0 mL/min。在波長220 nm處檢測洗脫峰并收集，凍干備用。

1.3.4 電噴霧-飛行時間-質譜

將純化后ACE抑制率高的組分溶解在H2O∶乙腈（85∶15）中，通過裝載有反相色譜柱（Agilent Proshell 300SB-C18，5μm，2.1 mm×75 mm）的LC-MS液質聯用儀完成肽的鑒定及分析。流速為0.2 mL/min，柱溫為30℃，流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：100%乙腈。洗脫條件：5%～30% B（0～20 min）和30%B（20～25 min）。

1.3.5 統計學分析

所有實驗均重復3次，用SPSS13.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 谷朊粉酶解物的制備

谷朊粉分別用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶和堿性蛋白酶在最適條件下酶解。用ACE抑制率的體外測定方法評價酶解物的ACE抑制能力。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解物的ACE抑制率在3 h內隨酶解時間的增加而增加，到3 h時抑制率趨于平衡。不同種類的酶酶解效果相差較大，其中堿性蛋白酶酶解物的ACE抑制率最高，其次是復合蛋白酶酶解物，木瓜蛋白酶酶解物的ACE抑制率最低。酶解3 h的堿性蛋白酶酶解物具有最高的ACE抑制率，高達（63.47±1.23）%。因此，選取堿性蛋白酶酶解3 h的谷朊粉酶解物作進一步研究。

2.2 ACE抑制肽的分離純化

2.2.1 超濾

選擇3 h的堿性蛋白酶酶解物用截留分子量（MWCO）為1 ku、2 ku和3 ku的超濾膜進行初步分離。所得組分分別命名為組分Ⅰ（Mr＜1 ku）、組分Ⅱ（1～2 ku）、組分Ⅲ（2～3 ku）和組分Ⅳ（Mr＞3 ku）。測定這些組分的ACE抑制率，結果如圖1所示。可見各組分的ACE抑制活性隨著分子量的減小而增加，組分I（Mr＜1 ku）具有較高的ACE抑制率（72.27±1.01%），組分Ⅳ（Mr＞3 ku）的ACE抑制率最低。SEGURA MR等[10]用豇豆分離蛋白酶解得到ACE抑制肽的作用效果類似。

2.2.2 葡聚糖凝膠色譜分離

將組分Ⅰ（Mr＜1 ku）用Sephadex G-15凝膠色譜柱進一步分離，得到1、2、3三個組分，結果見圖2，三個組分的ACE抑制率如圖3所示。由圖3可知，各組分與分離純化之前相比，ACE抑制率有一定幅度的提高，ACE抑制率最高為（75.25±1.34）%。其中組分2有較高的ACE抑制率，組分1的ACE抑制率最差。

2.2.3 RP-HPLC

將有較高ACE抑制率的組分2經RP-HPLC純化，得到4個組分（Fa、Fb、Fc、Fd），結果如圖4所示。將各個峰收集并測定其ACE抑制率，結果見圖5。由圖5可知，4個組分的ACE抑制率存在差異，其中Fb的ACE抑制率最低，Fd的ACE抑制率最高可達（81.03±1.20）%。

2.3 ACE抑制肽的鑒定

組分Fd經電噴霧-飛行時間-質譜（electrospray ionization time of flightmass spectrometry，ESI-TOF-MS）得到質譜圖如圖6所示，其氨基酸序列為色氨酸苯丙氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸（Trp-Phe-Gln-Pro）（WFQP），m/z為630.89。目前報道的大部分ACE抑制肽都是2～15肽[11]，且大部分含有疏水性氨基酸，其分子質量在200～1 500 u[12]。本實驗分離鑒定的ACE抑制肽的氨基酸組成也具有類似的特征。

ACE抑制肽的結構與活性之間的關系也是人們關注的重要內容，研究表明ACE抑制肽的活性主要取決于C-端氨基酸，C-端氨基酸為芳香族氨基酸和脯氨酸時，其抑制活性較高[13]。NAKAMURA Y等[14]以酸奶為原料制備ACE抑制肽異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（lle-Pro-Pro）；LU J等[15]從純頂螺旋藻酶解物中純化出ACE抑制肽纈氨酸-谷氨酸-脯氨酸（Val-Glu-Pro）；本研究分離鑒定的四肽C-末端也是脯氨酸Pro。可見Pro對ACE抑制肽的活性具有重要意義。谷朊粉中具有較高的脯氨酸含量[16]，因此，以谷朊粉為原料制備食源性ACE抑制肽具有顯著的資源優勢。

3 結論

本研究比較4種酶在最適條件下的酶解物的ACE抑制率，選取抑制率較高的堿性蛋白酶酶解物進行逐級分離（超濾、凝膠層析、RP-HPLC）得到ACE抑制肽，采用LC-MS的方法對該小肽進行鑒定。

結果表明，不同蛋白酶水解谷朊粉所得ACE抑制活性具有明顯差異，堿性蛋白酶的水解物活性較高。通過分離純化和質譜分析，鑒定出一個有較高活性的ACE抑制肽，其氨基酸序列為色氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸（Trp-Phe-Gln-Pro）。其氨基酸組成特征與文獻中報道其它來源的ACE抑制肽有相似之處[13-15]。這對研究ACE抑制肽的結構和功能關系具有重要意義，同時為谷朊粉的資源利用提供新途徑。

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Isolation and identification of ACE inhibitory peptide from wheat gluten hydrolysate

WANG Zhangcun1,WANGYing1,CAO Qin1,WANGXudong2,ANGuangjie1,ZHAO Xuewei1

(1.School of Food&Bioengineering,Zhengzhou University of LightIndustry,Zhengzhou 450000,China; 2.Zhengzhou NewwillNutrition Technology Co.,Ltd.,Zhengzhou 450000,China)

Using wheatgluten as raw materials and angiotensin-converting enzyme(ACE)inhibition rate as index,the effectof hydrolysis with four enzymes was compared.A novel ACE inhibitory peptide was purified by ultrafiltration,gelchromatography,RP-HPLC and then indentified by ESI-TOF-MS.The results showed that 3 h alkaline protease hydrolysates had higher ACE inhibitory activity;molecular weight of Mr less than 1 ku had higher ACE inhibition rate afterultrafiltration;the ACE inhibition rate ofpurified peptide from wheatgluten reached(81.03±1.31)%,the m/z was detected as 630.89 by ESI-TOF-MS,and the sequence and ofpurified peptide was Trp-Phe-Gln-Pro(WFQP).

wheatgluten;enzymatic hydrolysis;angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides;isolation;structuralidentification

TS209

A

0254-5071（2015）02-0060-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.014

2014-12-06

國家自然科學基金（31071517）

王章存（1963-），男，教授，博士，主要從事食品科學和農副產品加工研究工作。