米曲霉機理性探索對醬油生產的啟示

趙國忠，姚云平，唐曉姝，郝光飛，王春玲，侯麗華，陳 衛*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.天津科技大學 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津 300457）

米曲霉機理性探索對醬油生產的啟示

趙國忠1，姚云平1，唐曉姝1，郝光飛1，王春玲2，侯麗華2，陳 衛1*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.天津科技大學 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津 300457）

將相同培養條件下的不同米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株之間進行了比較基因組學和蛋白質組學的研究，分析醬油發酵過程中米曲霉的關鍵基因和蛋白對醬油風味產生的影響。通過米曲霉滬釀3.042（中國）和米曲霉RIB40（日本）菌株的基因組學比較，發現與醬油風味物質形成相關的特異基因。圍繞米曲霉3.042及其誘變菌株米曲霉100-8的蛋白質組學比較，找到米曲霉代謝過程中與風味物質形成有關的蛋白，為醬油工藝的改進提供了理論基礎。

米曲霉；醬油；比較基因組學；蛋白質組學

米曲霉（Aspergillus oryzae）是醬油制曲環節的主要菌株，因其在大曲發酵階段能產生豐富的酶類物質分解原料，對醬油風味的形成具有至關重要的作用。在中國，醬油釀造一般使用米曲霉滬釀3.042，而日本則多采用米曲霉和醬油曲霉混合菌種發酵。為獲得性狀優良的菌株，誘發突變或自發突變選育菌種被廣為使用。米曲霉100-8即是采用N+離子注入米曲霉滬釀3.042誘變所得，該突變株分泌偏酸性蛋白酶多，代謝速度快，符合工業化大生產的需要。2005年，日本米曲霉菌株RIB40全基因組序列得到破譯，但是應用基因組學對米曲霉在醬油發酵技術改進的研究卻未見報道。本文希望通過對米曲霉菌株的比較基因組學研究和蛋白質組研究，發現對醬油發酵風味有益的內在關系，改善我國的釀造醬油風味。

1 米曲霉基因組學比較

米曲霉滬釀3.042和米曲霉RIB40的基本特征如染色體大小、GC含量（鳥嘌呤（Guanine）和胞嘧啶（Cytosine）所占的比率）、開放閱讀框（open reading frame，ORF）數量及tRNA基因數量等，歸類結果如表1所示。通過MAUVE（版本2.3.1）全基因組比較后，發現米曲霉滬釀3.042和米曲霉RIB40菌株之間有很多的同源區域塊如圖1所示，有顏色的框代表的是在兩個菌中描述一致的線性區域（locally collinear blocks，LCBs）。該區域邊緣由于重組、插入或倒轉導致，因而產生了不同的contig。連接LCBs的垂線指示了染色體區域間的相似性，圖1上面的數字代表了核苷酸的位置信息。

由圖1可知，米曲霉滬釀3.042和米曲霉RIB40的蛋白質序列BLASTP比對（標準的蛋白序列與蛋白序列之間的比對）（相似度＞50%），結果顯示，它們有超過1 100個直系同源蛋白編碼基因（雙向比對），其余為各自特異基因，其中，一些特異基因與醬油發酵的風味形成有重要關系。

在前期米曲霉發酵釀造醬油過程中，米曲霉分泌大量胞外酶，比如蛋白酶和淀粉酶等。同時也產生了很多化合物，包括酯、醇、酸、醛、酮、酚、雜環分子、炔烴和苯[2]。然后，發酵大曲用鹽水混勻進入了后期厭氧發酵階段。其他酯類是無氧代謝的次級代謝產物，這些就組成了風味物質的最主要，也是最重要的成分。由于酯類物質能產生揮發性芳香類風味，所以它們在醬油發酵中的作用尤為重要。酯類可以通過不同種類醇和羧酸或者活性脂酰輔酶A （coenzyme，CoA）分子的催化作用在胞內形成[3]。CoA有關的酶類氧化脂肪酸生成酰基CoA然后催化生成酯類，醋酸酯類就是由乙醇和脂酰輔酶A為底物合成的。乙醇脫氫酶催化醛變為醇。米曲霉滬釀3.042菌株中的特異性酯酶（Ao3042_06598）既水解也可以合成酯鍵。同時，在米曲霉滬釀3.042菌株中特異性醛/酮還原酶（Ao3042_05141）能夠催化醛類的減少和酮轉變為醇[4]。在發酵過程中，水解酶可以分解原料為小分子物質，蛋白質和多肽可以水解成氨基酸和小肽。在醬油發酵過程中，微生物通過分解氨基酸或肽類化合物可以使風味物質得到平衡。米曲霉滬釀3.042特異基因中發現的D-氨基酰化酶（Ao3042_01621）一直被工業中用來生產D-氨基酸[5]。

米曲霉RIB40中的硒代半胱氨酸裂解酶（AO090120000084）可以專一地將硒代半胱氨酸分解成丙氨酸。米曲霉RIB40的絲氨酸O-乙酰轉移酶（AO090012000151）是半胱氨酸生物合成的重要酶類。此外，RIB40特異基因中的3-羥基苯甲酸氧合酶（3-hydroxyanthranilate oxygenase，HAAO）（AO090102000066）參與色氨酸新陳代謝，預苯酸脫水酶（AO090009000693）和蘇氨酸合酶（AO090038000224）也分別參與苯基丙氨酸和蘇氨酸的新陳代謝[6]。

2 米曲霉蛋白質組學比較

通過對米曲霉滬釀3.042和米曲霉100-8的二維凝膠圖蛋白質點的比較，經過一級質譜驗證以后，一共確認了522個蛋白點。其中有288個蛋白點在米曲霉100-8中有較高的表達豐度，而有163個蛋白點的表達豐度較低[7]。進一步的分析發現，有184個蛋白點只在米曲霉100-8中表達，這些點在米曲霉滬釀3.042中沒有表達。而有66個蛋白點只在米曲霉滬釀3.042中表達，在米曲霉100-8中沒有表達。碳代謝中包括糖酵解和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環途徑，其中米曲霉100-8有91個相關點表達量較高，36個相關點表達量下降。而在氮代謝的氨基酸代謝和合成途徑中，米曲霉100-8有43個點表達量升高，10個點下降[7]。

分析發現這些變化的點大多與醬油風味的產生有關，并且能解釋米曲霉100-8產醬油風味更好的原因。如兩個菌株在氨基酸合成和TCA循環中蛋白表達的差異可能會促進氨基酸和有機酸彼此之間的轉化，而這個改變肯定會導致發酵風味的差異。圖2是根據蛋白質組學比較結果繪制的碳代謝和氨基酸合成相關的中心代謝通路圖（反應相關酶見參考文獻[7]）。如圖2中蛋白質點的變化情況用顏色標出，紅色代表米曲霉100-8中表達上升的點，綠色代表表達下降的點，增加或降低的蛋白點的強度由顏色的深淺來表示。

氨基酸生物合成相關的酶如表2所示。由表2可知，芳香類氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸），支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）和含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）為產風味成分的主要氨基酸，在米曲霉100-8的氨基酸合成過程中，這些氨基酸合成相關的酶類表達量都有不同程度的升高（表達蛋白點標注參見參考文獻[7]）。

戊抗真菌素芳香類多肽（點155）的作用是可以催化莽草酸（shikimate）途徑中的芳香類酶[8]，風味氨基酸可以由shikimate途徑合成。點104是芳香類氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）生物合成途徑的第一步反應所需的酶，在這里米曲霉100-8中該酶的表達量也大大升高。二羥酸脫水酶（點116）和酮醇酸還原異構酶（點128）是支鏈氨基酸生物合成途徑中的關鍵酶。3-異丙基蘋果酸脫氫酶（點105）在甲硫氨酸鏈的延伸和亮氨酸合成過程中起重要的作用，并且該酶還催化3-異丙基蘋果酸到α-酮異己酸的氧化脫羧反應[9]。高絲氨酸脫氫酶（點126和127），高半胱氨酸合酶（點115）和單獨的維生素B12甲硫氨酸合酶（點115、137、484、135、136、138、139、140、141、142、143、144、145、146和147）催化甲硫氨酸合成過程中的反應。三磷酸甘油酸脫氫酶（點165）在米曲霉100-8中的表達也是下降的，可能是被絲氨酸的變構效應所抑制[10]。酵母氨酸脫氫酶（點131和132）在米曲霉100-8中的表達也降低了，從而減少了酵母氨酸產生L-賴氨酸的能力[11]。

芳香類氨基酸，支鏈氨基酸和含硫氨基酸等風味氨基酸在生物體內是伴隨著分解代謝不斷進行的，氨基酸的分解代謝生成了更多種類的風味物質，如氨基酸的轉氨基作用等。通過米曲霉蛋白質組學，發現在米曲霉100-8中也有不同氨基酸的代謝途徑部分酶表達水平的升高。在酪氨酸代謝途徑中，4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）（點106和107）催化4-羥苯基丙酮酸為風味產物2,5-二羥苯乙酸（高龍膽酸鹽）[14]。這個酶也同時參與苯丙氨酸的代謝過程。纈氨酸代謝過程中，甲基丙二酸鹽半醛脫氫酶（點156）催化甲基丙二酸半醛轉變為丙酰輔酶A。甘氨酸脫氫酶（點123）是甘氨酸分裂系統的一部分，甘氨酸羥甲基轉移酶（點124和125）通過甲基化或脫甲基作用實現甘氨酸和絲氨酸之間的相互轉變。谷氨酸/亮氨酸/苯丙氨酸/纈氨酸脫氫酶（valine dehydrogenase，VDH）（點117、118、119和120）在谷氨酸合成過程中起重要的作用。它的前體物質是α-酮戊二酸，在轉氨基過程中可以作為氨基接受體，是氨基酸轉變為風味物質的第一個限速反應[15]。轉氨基作用反應完以后，由相應的醛作用反應分解α-酮酸。

維生素B1生物合成酶在風味物質的形成過程中很重要。美拉德反應中，半胱氨酸和維生素B1可以產生類似肉的風味[16]。本實驗中，米曲霉100-8有兩個點（點495和496）明顯升高，而且是升高倍數最多的，這兩個點的表達分別升高7.6倍和8.1倍。米曲霉100-8中維生素B1生物合成蛋白表達量的增加會升高醬油中維生素B1的含量，帶來風味成分上的改變。

3 結束語

醬油的發酵過程是非常復雜的，尤其是米曲霉的參與過程。在米曲霉的參與階段，原料首先受到它所分泌的酶的水解作用。其次，米曲霉利用原料進行生命代謝活動，其代謝物分泌到體外，有的代謝物質在一定的環境條件下再次發生反應，這些即構成了醬油的風味物質成分。

通過對米曲霉滬釀3.042和米曲霉RIB40菌株特異基因的比較可知，米曲霉滬釀3.042和米曲霉RIB40在發酵過程中對不同類型氨基酸的代謝量不一樣。由醇和氨基酸反應生成的酯類物質也會有差別。由不同特異基因所編碼產生的醇、氨基酸、酯類化合物的不同比例必然會導致其所發酵出的醬油風味的差異。蛋白質組學研究發現，表達量變化的蛋白參與了糖酵解，TCA循環，氨基酸生物合成和二次代謝等重要途徑。

米曲霉基因組測序和凝膠蛋白質組圖譜的建立為更多更好的研究真菌其他未知領域提供必要的條件。同時，本文對醬油發酵工藝提供了一定的研究基礎，為改進我國的醬油釀造工業做出了貢獻。

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Exploring the mechanism ofAspergillus oryzae for soy sauce fermentation

ZHAOGuozhong1,YAO Yunping1,TANG Xiaoshu1,HAO Guangfei1,WANGChunling2,HOU Lihua2,CHENWei1*

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

Different Aspergillus oryzae underthe same culture condition was researched by comparative genomes and proteomics in soy sauce fermentation.The genomes of A.oryzae 3.042(China)and A.oryzae RIB40(Japan)were compared,and some specific genes which may be related to the flavor of soy sauce were found.Then,the proteomics of A.oryzae 3.042 and the mutantstrain A.oryzae 100-8 were compared,and the important proteins in metabolic processes were selected.These studies provided a theoreticalbasis for soy sauce fermentation.

Aspergillus oryzae;soy sauce;comparative genomes;proteomics

TS255.54

A

0254-5071（2015）02-0104-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.024

2014-11-24

第55批中國博士后科學基金面上資助（2014M551503）

趙國忠（1983-），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：陳 衛（1966-），男，教授，博士，研究方向為功能性微生物學。