餐廚垃圾微生物發酵生產蛋白飼料的工藝優化

蔡 靜，張紊瑋，贠建民，武建禎

（甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

餐廚垃圾微生物發酵生產蛋白飼料的工藝優化

蔡 靜，張紊瑋，贠建民*，武建禎

（甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

以餐廚垃圾為原料，采用酵母菌、黑曲霉和枯草芽孢桿菌作為混合發酵菌劑進行固態發酵，結合正交試驗，建立并優化了餐廚垃圾轉化為生物活性蛋白飼料的工藝條件。結果表明，最佳發酵工藝為以釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉（1∶1∶2）為混合菌劑，接種量1.0%，尿素添加量1.0%，30℃發酵48 h，含水量60%，在此發酵條件下發酵產物中粗蛋白含量提高了58.7%；粗纖維、粗淀粉和粗灰分含量均顯示下降；氨基酸總含量增加了1.08倍，其中必需氨基酸含量提高了95.9%；維生素B1、B2的含量也有顯著提高；微生物指標均符合國家飼料衛生標準（GB/T 5009.23—2006）。

餐廚垃圾；菌體蛋白；多菌發酵；工藝優化

餐廚垃圾是家庭、飲食單位拋棄的剩飯剩菜以及廚房殘余物的統稱，主要包括米和面粉類、蔬菜、動植物油、肉骨等食物殘渣，含水率高、成分復雜、營養成分高[1]，極易腐爛變質、散發惡臭、傳播細菌和病毒[2]。隨著社會的發展，人們生活水平的不斷提高，餐廚垃圾的產量也在逐年上漲[3-4]。目前我國餐飲垃圾的處理方法有以下幾種：直接排放、填埋、焚燒、堆肥，雖然這些方法處理了餐廚垃圾，但是均會產生不利影響[5-8]。餐廚垃圾營養成分很高，并沒有將餐廚垃圾資源化利用[9]。此外，餐廚垃圾大多數被直接用作動物飼料，由于其可能含有口蹄疫病菌、豬瘟病菌、弓形蟲、沙門氏菌等病原菌，未經處理直接飼養畜禽，會將其中的病菌通過食物鏈傳染給食用者，進一步對人體造成危害，形成惡性循環[10-11]，后果不堪設想。隨著畜牧業和飼料工業的發展，蛋白飼料的不足將成為全球性的問題。由于對蛋白飼料資料認識不足，不少可以開發的資源卻未能得到有效利用[12-13]。然而利用微生物將有機廢物轉化為蛋白質，生產的生物飼料具有消化吸收率高、適口性好，增加動物的采食量等優點[14]，不僅能夠提高資源的利用效率，而且對消除環境污染、改善生態環境都具有重要意義[15]。本試驗以餐廚垃圾為原料，采用多菌協生固態發酵技術，使微生物間進行有效的優勢互補[16]，以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母為發酵菌種，結合正交試驗設計方法對餐廚垃圾轉化為生物活性蛋白飼料的工藝條件進行了優化研究，旨在為餐廚垃圾的資源化高效利用提供技術支撐和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

餐廚垃圾：甘肅農業大學學生二號食堂。

1.1.2 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerivisia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillu ssubtilis）均為食品科學與工程學院微生物發酵實驗室自行保存。

1.1.3 培養基

酵母培養基：葡萄糖10 g，麥芽糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，NaCl5 g，蒸餾水1 000 mL，用于培養酵母菌。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯（去皮）200 g、蔗糖（或葡萄糖）20 g、水1 000 mL，pH值自然，用于培養黑曲霉。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值7.0～7.2，用于培養枯草芽孢桿菌。

固體發酵基礎培養基：經過預處理的餐廚垃圾用勻質機打漿，121℃滅菌20 min即為發酵基礎培養基。

1.1.4 試劑

硫酸鉀（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司；硫酸銅（分析純）、酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：成都市科龍化學試劑廠；硼酸（分析純）、乙醚（分析純）：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安秦空氣技術有限公司；ATN-300半微量凱氏定氮儀、SXT-06索氏提取器：天長市長城玻璃儀器制造廠；DH-600A恒溫培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；101-1-S-Ⅱ鼓風干燥箱：上海躍進醫療器械廠；FA1004B分析天平：上海佑科儀器儀表有限公司；HHS恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司；WFX-110B/120B/130B原子吸收分光光度計：北京北分瑞利分析儀器（集團）公司。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

粗蛋白的測定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；氨基酸組成和含量測定參照GB 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》；粗淀粉的測定參照GB/T 20194—2006《飼料中淀粉含量的測定》；還原糖的測定參照GB 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；粗灰分的測定參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；粗纖維的測定參照GB 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》；維生素B1、B2參照GB/T 14700—2002《飼料中維生素B1的測定》；礦質元素采用原子吸收分光光度法；黃曲霉毒素B1的測定參照GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2的測定》；病原菌的檢測：參照GB 4789.4—2010《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》等系列國家標準方法。

微生物指標測定：取發酵物樣品1 g置于9 mL無菌水中，充分混勻后，取1 mL進行梯度稀釋，選取合適的稀釋液分別涂布于適宜的培養基平板，37℃培養30 h，計數平板中的菌落數。

1.3.2 生產蛋白飼料的工藝流程

1.3.3 餐廚垃圾的采集及基本成分分析

餐廚垃圾取自甘肅農業大學學生二號食堂，主要是餐飲消費剩余的米面主食及植物類菜品。初步分揀去除一次性筷子、餐盒、紙巾等不可利用物，離心、去除部分水分，拌入10%～18%農產品加工副產物，置于4℃備用，經過以上方法處理的固體原料為研究對象。對主要的幾類食物殘余物，包括米和面粉主食類、蔬菜類、動植物油、肉骨類等基本成分進行分析，主要是化學成分分析，測定其中的粗蛋白、粗纖維、粗灰分、粗淀粉及還原糖含量。

1.3.4 菌種活化及液體菌種的制備

將菌種從4℃冰箱取出，無菌操作，用接種環挑取于相應固體培養基上培養24～48 h，作為斜面菌種。將活化好的斜面菌種無菌操作向250 mL液體培養基中接入少量菌種，150 r/min培養48～72 h，作為種子液。

1.3.5 最佳蛋白飼料的工藝條件的確定

分別研究接種量、混合菌種接種比例對餐廚垃圾發酵生產蛋白飼料的的影響，再依據單因素試驗結果，設氮源、含水量、溫度、發酵時間4個因素，以粗蛋白含量為評價指標確定最佳工藝條件。

1.3.6 發酵產物品質分析及安全性評價

研究發酵產物的主要理化成分及營養價值，開展生物安全性檢測及評價。

2 結果與分析

2.1 餐廚垃圾成分分析

對餐廚垃圾的基本成分分析，以便選擇不同發酵菌種、調整基礎培養基組成，為發酵試驗打下基礎，其結果見表1。

由表1可知，餐廚垃圾中含有較豐富的可供微生物發酵利用的碳源、氮源和礦質營養物質，可以作為微生物的基質發酵再利用。

2.2 菌種發酵試驗

2.2.1 單一菌種對固體發酵的影響

在餐廚垃圾中分別接入1.0%的黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母3種不同菌種，考察其在25℃條件下發酵48 h，對固體發酵的影響結果見圖1。

由圖1可知，向固體發酵發酵培養基中接入各種供試菌種均能顯著提高發酵產物的粗白含量。在相等的接種比例下，相同的培養條件下，黑曲霉對固體發酵培養基的粗蛋白含量的增幅最高，達到20.21%，由此確定出單一菌種發酵的最佳菌種為黑曲霉。

2.2.2 黑曲霉添加量對固體發酵的影響

接種量的大小會影響微生物生長繁殖的速度。因此，本試驗研究了不同接種量0.5%、1.0%、1.5%黑曲霉，考察在25℃條件下發酵48 h對固體發酵的影響，結果見圖2。

由圖2可知，不同黑曲霉接種量相同的培養條件下，接種量為1.0%對固體發酵培養基的粗蛋白含量的增幅最高，達到20.21%，因此黑曲霉最佳接種量為1.0%。

2.2.3 混合菌種對固體發酵培養基的影響

在發酵基質中按接種量1.0%，分別接入釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉以不同混合比例1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶2∶2、2∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1菌種種子液，在25℃條件下發酵48 h，考察其對固體發酵的影響，結果見圖3。

由圖3可知，相同的培養條件下，接種酵母菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌混合菌種，當釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉的接種比例為1∶1∶2時，發酵產物中的粗蛋白含量最高，達到21.82%。由此確定出混合菌種最佳接種比例為1∶1∶2。

2.3 混合菌種發酵條件優化

2.3.1 氮源種類對固體發酵的影響

氮源是微生物生長和產物合成的必要保障，直接影響發酵產物中粗蛋白的含量。因此，以混合菌種最佳接種比例為1∶1∶2，在氮源的添加量相同的條件下（添加量為1.0%），加入不同氮源種類時（磷酸二氫銨、硫酸銨、尿素），考察不同氮源在25℃條件下發酵48 h對固體發酵的影響，其結果見圖4。

由圖4可知，在相同的培養條件下，磷酸氫二銨、硫酸銨、尿素這三種氮源均可以提高固體發酵粗蛋白的含量。在添加量為1.0%的情況下，尿素對固體發酵粗蛋白含量的增幅高于其他氮源，因此，選擇尿素作為固體發酵的最適氮源。

2.3.2 尿素的添加量對固體發酵的影響

以尿素為最佳氮源，考察其在不同的添加量0.5%、1.0%、1.5%對混合菌種在25℃條件下發酵48 h，考察尿素的添加量對固體發酵產物粗蛋白含量的影響，其結果見圖5。

由圖5可知，當尿素添加量為1.0%時，固體發酵培養基的粗蛋白含量可達23.51%。因此最佳尿素添加量為1.0%。

2.3.3 不同含水量對固體發酵的影響

含水量過低，造成基質膨脹程度低，微生物生長受到抑制；含水量過大，難以通風降溫，造成產品的粗蛋白降低，而且使產品容易染菌。因此對不同含水量30%、40%、50%、60%、70%對固體發酵的影響進行了研究，結果見圖6。

由圖6可知，在相同的培養條件下，隨著含水量的增加，固體發酵培養基中的粗蛋白含量升高，含水量達到60%時，粗蛋白含量最高，為23.23%。但當含水量＞60%，粗蛋白含量降低。由此確定固體發酵最佳含水量為60%。

2.3.4 不同溫度對固體發酵的影響

溫度直接影響著微生物生長和代謝。由于是多種微生物對餐廚垃圾進行發酵，每種微生物具有不同的最佳生長溫度，因此要研究不同溫度25℃、30℃、35℃對固體發酵的影響，其結果見圖7。

由圖7可知，在相同的培養條件下，培養溫度為30℃時，發酵培養基中的粗蛋白含量最高，達到24.02%。由此確定固體發酵最佳溫度為30℃。

2.3.5 不同發酵時間對固體發酵的影響

發酵時間太短，微生物代謝產物積累少，粗蛋白含量少；發酵時間太長，影響產品品質。探究發酵時間對固體發酵的影響，其結果見圖8。

由圖8可知，在相同的培養條件下，培養時間為48 h時，發酵培養基中的粗蛋白含量最高，達到24.48%。由此確定固態發酵最佳培養時間為48 h。

2.4 正交試驗優化固體發酵條件

根據單因素試驗結果，進行4因素3水平的正交試驗，以餐廚垃圾發酵過程中產品粗蛋白含量為考察指標，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，對發酵產物粗蛋白含量影響由大到小依次為尿素添加量＞含水量＞發酵時間＞發酵溫度，A2B2C2D2為最優組合，即在以釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉（1∶1∶2）為混合菌劑，接種量1.0%的基礎上，尿素添加量1.0%，培養基含水量60%，發酵時間48 h，發酵溫度30℃。在此最佳條件下進行驗證試驗，最終產品中粗蛋白含量達到25.07%。

由表3可見，尿素添加量對發酵產物中粗蛋白含量的影響顯著，發酵時間、含水量、發酵溫度對粗蛋白含量的影響不顯著。因素作用的主次順序是尿素添加量＞含水量＞發酵時間＞發酵溫度，與極差分析得出的結果一致。

2.5 發酵產物主要理化成分及營養價值分析

2.5.1 營養價值分析

完成蛋白飼料生產工藝條件進行了優化后，對該工藝下的產品營養價值進行了分析。餐廚垃圾常規營養成分組成（以干物質計）分析測定結果見表4，菌體蛋白飼料礦質元素測定結果見表5，氨基酸組成與維生素含量的測定結果見表6。

由表4可知，發酵后的餐廚垃圾中粗蛋白含量比原料提高了58.7%，粗纖維、粗淀粉、粗灰分均有較大程度的下降，尤其是粗纖維含量降低幅度較大，減少了58.2%，說明餐廚垃圾發酵后營養價值得到了提高，適口性得到了明顯的改善。

由表5可知，發酵飼料中的礦質元素豐富，尤其是Ca、P、K、Mg含量最為豐富。

由表6可知，氨基酸總含量提高了1.08倍，必需氨基酸含量提高了95.9%，維生素B1、B2的比例也得到了提高。因此飼料的營養價值得到了提高。

2.5.2 衛生指標測定

以菌體蛋白飼料中生物毒素的含量及是否存在致病菌為指標來開展安全性評價，其結果見表7。

由表7可知，餐廚垃圾菌體蛋白飼料中的黃曲霉毒素檢測結果在國家飼料衛生標準之下，而致病菌（沙門氏菌）未檢測出來，說明用該工藝生產出的蛋白飼料是安全的。

3 結論

采用多菌協生混合發酵技術原理，將3種有益微生物復配，對餐廚垃圾轉化為生物活性蛋白飼料的工藝條件開展了優化研究。

在以釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶黑曲霉1∶1∶2為混合菌劑，接種量1.0%，添加1.0%尿素，發酵溫度30℃，發酵48 h，發酵產物中粗蛋白含量為25.07%，與原來未經處理前相比，提高了58.7%。粗纖維、粗淀粉、粗灰分均有大程度下降，尤其是粗纖維含量降低幅度較大，減少了58.2%，適口性到明顯改善。氨基酸總含量提高了1.08倍，必需氨基酸含量提高了95.9%，維生素B1、B2的比例也得到了提高，營養價值和風味都得到了較大的改善。微生物指標均符合國家飼料衛生標準，具有良好的安全性。

[1]莊禧懿，儲衛華，馬興旺，等.餐廚垃圾微生物發酵生產生物飼料的研究[J].化學與生物工程，2012，29（1）：84-86.

[2]WINFRIED R,MEYER-PITTROFF R.Utilizing waste products from the food production and processing industries[J].Crit Rev Food Sci Nutr, 2004,44(1):57-62.

[3]王延昌，袁巧霞，謝景歡，等.餐廚垃圾厭氧發酵特性的研究[J].環境工程學報，2009，3（9）：1677-1682.

[4]GRIFFIN M,SOBAL J,LYSON T A.An analysis of a community food waste stream[J].Agriculture and Human Values,2009,26(1-2):67-81.

[5]戚建強，孫紅軍，李 紅.餐廚垃圾處理技術進展探討[J].綠色科技，2012，1（1）：127-129.

[6]WENG B Q,ZHANG W L,WANG Y X.Path exploration and countermeasure innovation for developing circularagriculture in southeast China [J].Asian Agr Res,2014,6(3):20-25.

[7]王毅琪，趙云成，劉 佳.城市生活垃圾綜合處理工藝及發展[J].環境衛生工程，2014，22（2）：8-11.

[8]朱 蕓，王丹陽，弓愛君，等.餐廚垃圾的處理方法綜述[J].環境衛生工程，2011，19（3）：50-52.

[9]ZHU L Z.Value circulation theory-based on practices of agriculturalcircular economy[J].Asian Agr Res,2013,5(5):1-2.

[10]崔士亮.餐飲廢棄物利用的現狀和技術[J].中國科技信息，2011（3）：24-25.

[11]鄔蘇煥，宋興福，劉夠生，等.雙菌固態發酵處理餐廚垃圾[J].食品與發酵工業，2004，30（5）：63-67.

[12]STREIT WR,ENTCHEVAP.Biotin in microbes,the genes involved in its biosynthesis,its biochemicalrole and perspectives for biotechnologicalproduction[J].Appl Microbiol Biotechnol,2003,61(1):21-31.

[13]肖 娟，盧海威，劉 陽，等.餐廚垃圾資源化處理工藝研究[J].環境科技，2011，24（2）：119-121.

[14]劉穩結，王際輝，葉淑紅，等.高蛋白豆粕飼料發酵條件研究[J].中國釀造，2010，29（2）：127-130.

[15]龔 仁，宋 鵬，陳五嶺.餐廚垃圾發酵生產生物活性蛋白飼料的工藝研究[J].飼料工業，2008，29（24）：39-42.

[16]陳洪偉，葉淑紅，王際輝，等.混菌固態發酵麩皮制備蛋白飼料的研究[J].中國釀造，2011，30（6）：74-77.

Optimization of microbial fermentation process to produce protein feed from kitchen waste

CAIJing,ZHANG Wenwei,YUNJianmin*,WU Jianzhen

(College of Food Science and Engineering,Gansu AgriculturalUniversity,Lanzhou 730070,China)

Using kitchen waste as raw material,Saccharomyces cerevisiae,Aspergillus niger and Bacillus subtilis as mixed fermentation starter,combining with orthogonaltest,the protein feed solid-state fermentation processing condition was optimized.The results showed thatthe optimum fermentation process was S.cerevisiae∶B.subtilis∶A.niger(1∶1∶2),inoculum 1.0%,urea addition 1.0%,temperature 30℃,time 48 h,and moisture 60%. Under these conditions,crude protein contentof fermentation productincreased 58.7%;the crude fiber,starch and ash content decreased;total amino acid content increased 1.08 times,in which the essential amino acid content increased 95.9%;vitamin B1,B2content significantly increased,and the microbialindexes metthe NationalFeed Hygiene Standards(GB/T5009.23—2006).

kitchen waste;mycoprotein;mixed-microbe fermentation;process optimization

TS264.2

A

0254-5071（2015）02-0114-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.026

2014-11-25

國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201310733002）

蔡 靜（1992-），女，本科生，研究方向為發酵微生物。

*通訊作者：贠建民（1968-），男，教授，博士，研究方向為微生物發酵工程。