白斑狗魚魚肉中抗凍蛋白的分離純化

鞏子路，田童童，張 建，牛玉靜，劉 娟，李 甜

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

白斑狗魚魚肉中抗凍蛋白的分離純化

鞏子路，田童童，張 建*，牛玉靜，劉 娟，李 甜

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

利用單因素試驗及響應(yīng)面分析法將從白斑狗魚魚肉組織中獲取的抗凍蛋白進行分離純化。試驗以魚肉抗凍蛋白的熱滯活性（THA）為響應(yīng)值，對提取溫度、pH值、提取時間、料液比4個因素進行優(yōu)化。結(jié)果表明：白斑狗魚魚肉中抗凍蛋白提取的最佳工藝條件為溫度5.14℃、pH值8.40、提取時間為1.88 h，料液比1∶2（g∶mL），此時熱滯活性達(dá)到0.061 2℃。驗證試驗結(jié)果顯示熱滯活性（THA）為（0.059 4±0.001 3）℃，與理論預(yù)測值基本吻合。經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-50分子篩層析柱純化后獲得了電泳純的抗凍蛋白，其相對分子質(zhì)量約為7.6 ku，熱滯活性大約為（0.052±0.001 5）℃。

白斑狗魚；抗凍蛋白；分離；純化

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是一類抑制冰晶生長的蛋白質(zhì)，它能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點而對其熔點影響甚微。從而導(dǎo)致水溶液的熔點（melting point，MP）和冰點（freezing point，F(xiàn)P）之間出現(xiàn)差值，這種差值稱為熱滯活性（thermalhysteresis activity，THA）。因而抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白（thermalhysteresis proteins，THPs）[1]。抗凍蛋白具有特殊的功能和熱滯性質(zhì)，能夠降低冰點、抑制冰晶的生長和重結(jié)晶，修飾冰晶的形態(tài)[2]。抗凍蛋白廣泛分布于魚類、昆蟲、植物以及微生物[3-6]中，DAVIES P L等[7]于1990年首先報道了魚類AFP的生物化學(xué)特性和分子結(jié)構(gòu)。隨后的研究中，越來越多的AFP結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的5類AFP（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和AFGP）都具有THA。抗凍蛋白通過吸附到冰晶表面，由于Kelvin效應(yīng)使冰晶的生長處于熱力學(xué)上不利的狀態(tài)，從而抑制冰晶的生長，保護避免結(jié)冰或者對結(jié)冰敏感的生命有機體免受結(jié)冰引起的傷害。由于抗凍蛋白具有阻止冰晶生長而不破壞細(xì)胞的特點，因而有望在食品原料的冷處理、冷凍食品的保鮮等方面發(fā)揮重大作用[8-11]。

本實驗以生存于新疆北部額爾齊斯河流域的白斑狗魚為研究對象，以魚肉作為實驗原材料，通過傳統(tǒng)的分離方法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取抗凍蛋白的工藝參數(shù)，并且通過陰離子交換柱層析及凝膠柱層析對抗凍蛋白進行純化，以期為今后抗凍蛋白的發(fā)展與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白斑狗魚：購買于石河子市農(nóng)貿(mào)市場；丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、考馬斯亮藍(lán)R-250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和四甲基乙二胺（tetramethylethylene-diamine，TEMED）：美國Sigma公司。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、維生素C（vitamin C，VC）：中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DEAE-Sepharose和Sephacryl S-500：美國GE-Healthcare Bio-Sciences AB公司；PVDF膜：美國Millipore公司；Mini-proteinⅢ：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將從市場上購買的活體白斑狗魚麻醉，再將其魚肉組織從魚體剝離，立即用液氮冷凍，置于組織搗碎機中進行粉碎，之后置于-70℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩７Q取一定量處理好的魚肉樣品與等體積的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）充分混合，于4℃冷藏箱中靜置過夜。然后于5 000 r/min、4℃的條件下離心分離10 min，棄去沉淀，取上清液，并且將其進行冷凍干燥，所得干燥樣品即為白斑狗魚魚肉抗凍蛋白粗品。

1.3.2 單因素試驗

以Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，將處理好的樣品分別按照試驗預(yù)設(shè)的不同料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）、不同pH值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，不同浸提溫度-4℃、0℃、4℃、8℃、12℃和不同提取時間0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h等條件探討分析各個單因素對魚肉抗凍蛋白提取效果的影響。

1.3.3 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

試驗通過對可能影響魚肉抗凍蛋白提取的4個因素[13]（料液比、pH值、提取溫度和提取時間）進行詳細(xì)的單因素試驗分析。為了得到魚肉抗凍蛋白提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以熱滯活性（THA）（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）對魚肉抗凍蛋白的提取進一步的優(yōu)化[12]。響應(yīng)面分析因素與水平編碼如表1所示。

1.3.4 魚肉抗凍蛋白的純化

將所得到的魚肉抗凍粗蛋白按照一定比例溶解于Tris-HCl（50 mmol/LTris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC，pH 7.5）緩沖液中，通過針孔濾膜（0.45μm）過濾后置于透析袋中過夜透析，期間更換透析液3～4次，然后將透析液進行超濾濃縮至一定濃度，通過陰離子柱進行層析分離，用4倍體積Tris-HCl（pH 7.5）洗脫，再用含0～0.8 mol/L NaCl的600 mL Tris-HCl進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，5 mL/管分管收集。紫外檢測器的檢測波長調(diào)節(jié)至280 nm。通過弱陰離子交換柱層析后具有活性的收集液用3 ku超濾膜進行超濾濃縮到5 mL，以待進一步純化。

1.3.5 SDS-PAGE電泳

十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參照CHALKLEY RJ等[15]報道的方法進行實驗。樣品與樣品緩沖液按照1∶1（v/v）的比例混合，沸水浴5 min，上樣量10μL，分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.0%和5%。樣品分別在80 V和120 V恒壓的條件下在凝膠中遷移，濃縮膠中遷移30 min后進入分離膠直到指示劑距離凝膠板邊緣1 cm左右處停止電泳，整個電泳試驗大概為3 h。從凝膠板取下電泳膠片，將其置于染色缸中于搖床上染色40 min，染色結(jié)束后于脫色液中脫色24 h，期間更換染色液4～5次。樣品分子質(zhì)量的確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的相對遷移率計算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC，pH 7.5）作為提取液，按照不同比例與凍干的白斑狗魚魚肉樣品混合，其他條件保持在一個水平，探討不同料液比對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，白斑狗魚魚肉抗凍蛋白的熱滯活性隨著料液比的增加而上升，且在料液比為1∶4（g∶mL）時達(dá)到最高，其THA為（0.048 0±0.001 3）℃。繼續(xù)增加料液比的比例，魚肉中的抗凍蛋白的熱滯活性呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。這可能是因為抗凍蛋白熱滯活性的高低與抗凍蛋白的含量有一定的相關(guān)性，起初隨著料液比增加，蛋白質(zhì)也隨著不斷的溶出，含量隨之而升高，因此熱滯活性也越來越大，然而料液比過高，原料中總蛋白質(zhì)含量是一定的，因此，抗凍蛋白含量會相對較低，故其熱滯活性呈現(xiàn)下降的趨勢。因此確定最佳料液比為1∶4（g∶mL）。

2.1.2 pH值對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）的緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）與凍干的魚肉樣品混合，其他條件保持在一個水平，探討不同pH值對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著pH值的不斷上升，魚肉中抗凍蛋白的熱滯活性呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，當(dāng)pH值為8.0時，魚肉抗凍蛋白的熱滯活性達(dá)到最高，其THA值為（0.052 0± 0.002 4）℃。繼續(xù)升高pH值，抗凍活性呈現(xiàn)出較緩慢的下降趨勢。這主要是因為蛋白質(zhì)在酸性溶液中溶解度低，堿性溶液中溶解度高而造成的。隨著pH值增加，蛋白質(zhì)溶解度在不斷的增加，所以蛋白濃度逐漸升高，抗凍蛋白熱滯活性也隨之升高，然而，當(dāng)pH值為9.0時，其熱滯活性略微呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因為在堿性較強的環(huán)境下破壞了抗凍蛋白的空間結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致其熱滯活性下降。因此確定最佳提取pH值為8.0。

2.1.3 提取時間對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用pH 8.0的緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）與凍干的魚肉混合，其他條件保持在一個水平，探討不同的提取時間對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著時間的延長，魚肉中抗凍蛋白的熱滯活性也在不斷的升高，當(dāng)時間達(dá)到2.0 h，魚肉抗凍蛋白熱滯活性達(dá)到最高，其THA值為（0.055 0±0.001 8）℃。繼續(xù)延長浸提時間，魚肉抗凍蛋白的熱滯活性基本保持不變，而THA值呈現(xiàn)出略微下降趨勢。這可能與蛋白質(zhì)在浸提液中的溶出速率有關(guān)，在2.0 h之前，魚肉抗凍蛋白沒有完全的溶解于浸提液中，因此隨著時間的延長表現(xiàn)出熱滯活性增加，而2.0 h之后，魚肉的抗凍蛋白基本溶解完全，達(dá)到了最大濃度，所以熱滯活性基本保持不變。因此確定2.0 h為最佳提取時間。

2.1.4 不同溫度對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用pH 8.0的緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）與凍干的魚肉混合，提取時間設(shè)定為2.0 h，探討不同提取溫度對魚肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著溫度的不斷升高，魚肉抗凍蛋白的熱滯活性也在不斷的上升，當(dāng)溫度升高至4℃時，熱滯活性達(dá)到最高（0.065 0±0.002 4）℃。這可能是因為該魚本身生活的特殊地理環(huán)境有關(guān)，盡管其生活在氣候條件較寒冷的湖泊海域中，但是溫度過低對其抗凍蛋白熱滯活性也具有一定程度的影響。蛋白質(zhì)在較高的溫度下，其排列緊密的空間結(jié)構(gòu)會變得松散，有利于蛋白質(zhì)的溶出，從而會使其抗凍蛋白的含量不斷增加，因此熱滯活性也隨之升高。然而抗凍蛋白的特殊屬性使其在溫度過高時會很大程度影響其原有的固有屬性，其熱滯活性呈現(xiàn)出下降的趨勢。因此確定4℃為最佳提取溫度。

2.2 響應(yīng)面分析法結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為了得到更優(yōu)的分離提取抗凍蛋白的工藝參數(shù)，利用Design-Expert8.0軟件中的中心組合設(shè)計（center composite design，CCD）原理對4個單因素進一步優(yōu)化。試驗結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果如表3所示。

當(dāng)P＜0.05時，影響因素對響應(yīng)值影響為差異顯著，當(dāng)P＜0.001 0時為差異高度顯著，P＜0.000 1時為差異極顯著。表3中顯示模型的P=0.0002＜0.05，說明試驗?zāi)Ｐ途哂酗@著性，失擬項的P=0.076 7＞0.05，不顯著，表明響應(yīng)面設(shè)計的模型與實際試驗擬合良好。由表3可知，X2的P=0.001 5＜0.05，表明pH值起著顯著性的影響；X1的P=0.058＞0.05，說明影響不顯著，說明溫度的影響次于pH值。各個因素經(jīng)過回歸擬合后，經(jīng)解得到的抗凍蛋白熱滯活性的回歸方程為：

通過軟件求解方程，得出最優(yōu)工藝條件為溫度5.14℃、pH 8.40、提取時間為1.88 h，液料比1∶2（g∶mL），在此條件下，抗凍蛋白熱滯活性達(dá)到0.061 2℃。為檢驗?zāi)Ｐ偷目煽啃裕M行驗證試驗，結(jié)果顯示熱滯活性為（0.059 4±0.001 3）℃，與理論預(yù)測值基本吻合。

通過回歸優(yōu)化得出響應(yīng)曲面及等高線[14]如圖5所示。

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強弱大小。圖形為網(wǎng)形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。由圖5A可知，隨著pH值和溫度不斷增加，熱滯活性也在逐漸升高。由圖5B可以明顯看出，溫度對魚肉中的抗凍蛋白的熱滯活性具有較顯著的影響。圖5C可以明顯看出，溫度和料液比均顯示出二次影響。隨著溫度和料液比不斷升高，熱滯活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。由圖5D可知，曲面的坡度比較陡，說明二者之間的交互作用對抗凍蛋白的熱滯活性的影響顯著，該結(jié)果在表1方差分析中也得到驗證。圖5E可以看出，pH值和料液比對熱滯活性都表現(xiàn)出二次效應(yīng)，隨著pH值和料液比的增加，熱滯活性也在不斷的上升，說明pH值和料液比交互作用對熱滯活性的影響是顯著的。圖5F結(jié)果表明時間和料液比對抗凍蛋白的熱滯活性均表現(xiàn)出二次效應(yīng)。

2.3 白斑狗魚魚肉抗凍蛋白的分離純化

白斑狗魚魚肉中抗凍蛋白樣品經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-50分子篩柱洗脫圖譜分別如圖6所示，魚肉抗凍蛋白的電泳圖譜如圖7所示。

由圖6A可知，魚肉抗凍蛋白樣品經(jīng)過DEAE-Sepharose陰離子交換層析后得到一個較為明顯的吸收峰，經(jīng)電泳檢測后顯示該峰下的蛋白質(zhì)為雜質(zhì)蛋白，如圖7A所示。將蛋白含量較高的收集管合并，超濾濃縮至5 mL，然后經(jīng)過Sephadex G-50分子篩柱進行層析純化。由圖6B可知，凝膠層析后得到一個魚肉抗凍蛋白吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測得知該峰下的蛋白質(zhì)為電泳純的抗凍蛋白，且只含有一個亞基，其相對分子質(zhì)量約為7.6 ku，如圖7B所示。此時，測定該電泳純的抗凍蛋白的THA約為（0.052 0±0.001 5）℃。

3 結(jié)論

白斑狗魚魚肉中抗凍蛋白提取的最佳工藝條件為溫度5.14℃、pH 8.40、提取時間1.88 h、料液比1∶2（g∶mL），此時熱滯活性達(dá)到0.061 2℃。驗證試驗結(jié)果顯示白斑狗魚魚肉中抗凍蛋白的熱滯活性為（0.059 4±0.001 3）℃，與理論預(yù)測值基本吻合。

利用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-50分子篩層析柱對獲得的抗凍蛋白粗品進一步的純化，實驗結(jié)果表明，白斑狗魚魚肉組織中的抗凍蛋白粗品經(jīng)過陰離子交換柱層析后確實有一個較明顯的蛋白吸收峰，但是經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測后，發(fā)現(xiàn)該處的抗凍蛋白樣品為雜蛋白，電泳膠片上蛋白樣品條帶較多，未能達(dá)到電泳純。將經(jīng)過DEAE-Sepharose FastFlow陰離子交換柱所得的具有活性的蛋白收集合并，然后繼續(xù)通過Sephadex G-50分子篩層析柱進行分離純化，所得的層析圖譜與陰離子柱層析的圖譜相類似，同樣有較明顯的蛋白吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，此處的蛋白樣品達(dá)到電泳純，且只含有一個亞基，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的相對遷移率計算獲得其分子質(zhì)量約為7.6 ku。同時，測定該電泳純的抗凍蛋白的THA約為（0.052 0±0.001 5）℃。

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Isolation and purification of antifreeze protein from muscle tissues ofEsox lucius

GONG Zilu,TIANTongtong,ZHANGJian*,NIU Yujing,LIU Juan,LITian

(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Antifreeze protein(AFP)from muscle tissues of Esox lucius was isolated and purified by single factor experiment and response surface methodology.Furthermore,the extraction time,extraction temperature,extraction buffer pH and water to materialratio was comprehensively detected with thermalhysteresis activity(THA)as the evaluation index.Results showed thatthe THA of AFP from muscle tissues of E.lucius was up to 0.061 2℃under the optimized condition of extraction temperature 5.14℃,sample solutions pH 8.40,extraction time 1.88 h and solid to liquid ratio 1∶2(g∶ml).In addition,the verification experiment showed that the THA was(0.059 4±0.001 3)℃,similar to the experimentvalue.After DEAESepharose fastflow anion exchange column and Sephadex G-50 molecular chromatography column purification,AFP of electrophoresis level with 7.6 ku molecularweightwas obtained by furtherchromatographic purification,and the THA was about(0.052±0.001 5)℃.

Esox lucius;antifreeze protein;isolation;purification

Q51

A

0254-5071（2015）02-0120-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.027

2014-12-30

國家自然科學(xué)基金（31260366）；石河子大學(xué)青年骨干教師培訓(xùn)項目（3152SPXY01027）

鞏子路（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品生物化學(xué)。

*通訊作者：張 建（1979-），男，副教授，博士，研究方向為食品生物化學(xué)研究工作。