UPLC法同時檢測新疆葡萄酒中的7種單體酚

趙建勇，任水英

（國家農副產品監督檢驗中心（新疆），新疆 烏魯木齊 830011）

UPLC法同時檢測新疆葡萄酒中的7種單體酚

趙建勇，任水英

（國家農副產品監督檢驗中心（新疆），新疆 烏魯木齊 830011）

建立了一種測定葡萄酒中7種單體酚含量的超高效液相色譜（UPLC）檢測方法。采用ACQUITY BEH C18色譜柱，以甲醇/乙酸銨-乙酸緩沖溶液為流動相，0.2 mL/min梯度洗脫，變波長檢測，各化合物線性關系較好（R2＞0.993），不同的添加水平的回收率在84.0%～108.4%范圍，方法重復性較好（RSD≤6.08%）。該文利用UPLC法分析了不同地區、不同年份的葡萄酒中7種單體酚的含量，結果表明，葡萄酒中含有豐富的單體酚，單體酚的含量因酒樣含糖量、品牌、廠家和原料產地不同而差別很大。

UPLC；葡萄酒；單體酚

葡萄中的多酚化合物對果實的色澤、風味以及葡萄酒的口感、營養價值都具有重要的作用，同時，多酚類化合物對一些嚴重危害人體健康的慢性疾病如肥胖、心臟病、癌癥等具有一定的治療或預防作用，在醫療、保健方面有著重要的利用價值[1-4]。所以對葡萄酒單體酚化合物的分析檢測具有重要的意義。

然而，現行的葡萄酒檢測標準中，并未制定出單體酚的限量指標[5]及檢測方法[6]。由于缺乏特征性檢測指標，當今葡萄酒魚龍混雜，很多勾兌酒嚴重影響著消費者的身心健康。為此，為了鑒別葡萄酒的真假，近年來許多學者對葡萄酒中酚類物質的高效液相色譜分析方法進行了研究[7-11]。而超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）不但縮短了分析時間，同時也提高了分離度。本研究建立了葡萄酒中7種單體酚的UPLC檢測方法，旨在探討“真假葡萄酒的特征性指標群”，為真假葡萄酒的診斷和打假執法提供可靠的方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10個葡萄酒樣品為本實驗室檢驗用樣品，含糖量（分為干型、半干型、甜型）、商標、廠家、原料產地均有不同。

咖啡酸、沒食子酸、兒茶素、阿魏酸、白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚標準物質（純度98.5%）：美國Sigma公司；甲醇（色譜級）：美國Fisher公司；乙酸銨、乙酸（優級純）：天津市光復科技發展有限公司；乙酸乙酯（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters Acquity UPLCH-class超高壓液相色譜儀：美國Waters公司；電子天平（0.1 mg）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UPHW型優普超純水凈化系統：成都超純科技有限公司；IKARRV10旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取各標準品10.0 mg于10 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑配成1.00 mg/mL的標準儲備溶液，4℃冷藏避光保存。

標準中間液：取上述標準儲備液1 mL到50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，配成20μg/mL的混合中間標準溶液，4℃冷藏避光儲存。

標準工作液的配制：用超純水稀釋混合中間標準溶液，得到系列標準混合工作液，質量濃度分別為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITYBEHC18（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：A（0.01 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖溶）和B（甲醇），流動相梯度洗脫見表1。流速：0.2 mL/min；進樣體積：10μL；柱溫：30℃；波長：0～4.0 min，280 nm；4.0～7.0 min，320 nm；7.0～16.0 min，280 nm。

1.3.3 樣品前處理

稱取25 g（精確到0.01 g）混勻的葡萄酒，用25 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，用旋轉蒸發儀（＜40℃）濃縮近干后，甲醇∶水（4∶1，V/V）溶液定容5 mL，置于-4℃下避光保存，待液相分析用。進樣前經0.22μm微孔濾膜過濾。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇

前處理是分析檢測中一個非常重要的環節，直接影響著最終結果的準確性。文獻中將樣品pH值調節到2.0[12]或者7.0[13-14]再萃取，或者直接萃取3種方法[15]。本實驗對3種方法進行了比較，結果表明，將pH值調節到7.0時，萃取速度緩慢，乳化現象嚴重，延長了處理時間；未調pH的樣品和pH=2.0的樣品萃取速度相當。將萃取液旋轉蒸發后測試，發現同樣的條件下，pH=2.0的樣品基質較多。故本實驗選擇直接從樣品中萃取。由于目標化合物均呈弱酸性，酒體本身也呈酸性（pH值約為4.0），可以使單體酚類物質以分子狀態形式存在于酒體中，有利于有機相的萃取。

2.2 檢測波長的選擇

本實驗采用二極管陣列檢測器對7種單體酚進行波長掃描，掃描波段為200～400 nm。結果表明，除兒茶素和咖啡酸兩種化合物最大吸收波長在320 nm之外，另外5種目標化合物在波長280 nm條件下均有較好的響應值，故本實驗采用變波長掃描。在兒茶素和咖啡酸流出時間段掃描波長定在320 nm，其他分析時間檢測波長均為280 nm。

2.3 流動相的選擇

考察了常用的甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相，發現在此溶液洗脫時，保留時間存在著漂移，再現性不好。本實驗將流動相改為甲醇/乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.45），克服了pH值變化帶來的影響，保留時間重現性好。

2.4 標準品、樣品色譜圖與標準曲線

將混合標準溶液及樣品在確定的色譜條件下進行測試，得到7種混標以及樣品的色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，各組分分離效果好。

將5水平的標準溶液分別進樣，根據質量濃度（X）和峰面積（Y）作標準曲線，7種目標化合物的線性方程及相關系數如表2所示，由表2可知，各化合物線性關系良好（R2＞0.993），儀器檢出限低，此方法能滿足定量分析的要求。

2.5 方法的回收率和檢出限

對樣品按照1.3.3前處理方法方法進行前處理，按照1.3.2色譜條件上機測試，每個水平平行分析2次，計算本方法的加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。結果如表3所示。結果表明，各化合物在不同的添加水平都得到了較滿意的回收率（84.0%～108.4%）和較好的方法重復性（RSD≤6.08%）。

2.6 樣品分析

從市場上抽取10個樣品，采用本方法對樣品進行處理、分析，其單體酚含量測定結果見表4。

從表4可知，10種樣品中均含有豐富的單體酚，但不同樣品中單體酚含量差別很大，尤其是沒食子酸和兒茶素；單體酚的含量受酒樣的品牌和生產地域影響較大，這可能是釀酒原料葡萄及釀造工藝的不同所致。

3 結論

建立了葡萄酒中7種單體酚的UPLC檢測分析方法，以ACQUITY BEH C18色譜柱作為分離柱，以甲醇/乙酸銨-乙酸緩沖溶液（pH=3.45）為洗脫液，克服了pH值變化帶來的影響，各目標化合物分離效果良好，在不同的添加水平都得到了較滿意的回收率（84.0%～108.4%）和較好的方法重復性（RSD≤6.08%）。樣品分析結果顯示，葡萄酒中含有豐富的單體酚，各單體酚含量差異很大。葡萄酒中的含糖量、原料產地、釀造方式都會影響單體酚的含量。

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Determination of 7 mono-phenols in Xinjiang wines by UPLC

ZHAO Jianyong,RENShuiying

(National Quality Supervision Test Center of Agricultural Byproducts(Xinjiang),Urumqi 830011,China)

A UPLC method was developed for determining 7 mono-phenols in wines.The chromatographic separation was performed on an ACQUITY BEH C18column eluted with mobile phase of methanol/ammonium acetate-acetic acid mixture ata flow rate of 0.2 ml/min.The detection wavelength was variable with the change ofmaximum wavelength.The calibration curves of7 mono-phenols were linear with correlation coefficients more than 0.993,recovery rate 84.0%-108.4%,and the method repeatability was good(RSD≤6.08%).Differentaging times and different geographical origins of wine were determined.The results showed thatwine was rich in mono-phenols,and their contents were distinct with the difference of sugarcontent,brand,producer and geographicalorigins of raw materials.

UPLC;wine;mono-phenol

TQ201

A

0254-5071（2015）02-0139-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.031

2014-12-29

國家質檢總局科研計劃項目（2011QK385）

趙建勇（1973-），男，工程師，碩士研究生，主要從事食品檢驗工作。