Kruppel樣因子4在胃癌細胞中的表達及KLF4基因啟動子區的生物信息學分析

楊 菁 周 力 許 鐘 (貴陽醫學院附屬醫院消化內科，貴州 貴陽 550002)

Kruppel樣因子4在胃癌細胞中的表達及KLF4基因啟動子區的生物信息學分析

楊 菁 周 力 許 鐘 (貴陽醫學院附屬醫院消化內科，貴州 貴陽 550002)

目的 檢測Kruppel樣因子KLF4基因在人胃癌細胞株MKN－45及人正常胃黏膜上皮細胞株GES－1的表達情況，并應用生物信息學方法分析KLF4基因啟動子區序列，預測胃癌發生中其涉及的轉錄調控因子。方法 采用實時熒光定量PCR方法檢測MKN－45及GES－1中KLF4 mRNA的表達;利用多種在線軟件獲取并分析人KLF4基因啟動子序列，預測其轉錄因子結合位點和胃癌組織中相關的轉錄因子。結果 實時定量PCR檢測結果顯示:KLF4 mRNA在人胃癌細胞株MKN－45中的表達低于在人正常胃黏膜細胞株GES－1中的表達(4.24±0.15 vs 6.66±0.23)(P＜0.01);KLF4基因啟動子序列全長為4 915 bp，共涉及183個轉錄因子結合位點，在胃癌中異常表達的轉錄因子有17個，包括AP－1、AP－2、HIF－1、SP3等。結論 KLF4 mRNA在胃癌細胞株MKN－45中表達下調，生物信息學分析提示在胃癌發生中AP－1、AP－2、HIF－1、SP3轉錄因子等可能參與調控KLF4的表達。

Kruppel樣因子4;胃腫瘤;啟動子;生物信息學

Kruppel樣因子(KLF)4是真核生物中含有3個鋅指結構的轉錄因子，在消化道組織細胞中幾乎均可檢測到其表達〔1〕，故又稱其為胃腸富集型KLF。然而，KLF4在各消化道組織細胞中的表達程度不盡相同，且在不同的消化道組織細胞中可與不同的生物因子相互作用，因此會產生促癌或者抑癌的不同效應。大量研究表明KLF4低表達于胃癌組織細胞中〔2～4〕，由此可證明其在胃腸道腫瘤中主要起抑癌作用。但是，KLF4自身的表達調節機制至今尚未完全闡明。我們設想，能否通過基因工程方法使正常胃黏膜細胞或胃癌細胞內KLF4的表達維持在較高水平，從而延緩甚至是逆轉胃癌的發生發展。基于以上設想，本研究通過實時熒光定量PCR檢測KLF4在胃癌細胞株MKN－45及正常胃黏膜細胞GES－1中的表達情況，并利用生物學信息技術對人KLF4基因序列、啟動子區進行分析，獲得該基因啟動子區轉錄因子結合位點，進一步篩選出胃癌中KLF4基因可能的轉錄調控因子，以期采用人工干預手段使KLF4基因在胃腸道正常細胞及腫瘤細胞中過表達，為后續研究提供理論指導和實驗基礎，為胃腸道腫瘤的預防和治療尋求新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料、細胞株和試劑 人胃癌細胞株SGC－7901、MKN－45和人正常胃黏膜上皮細胞株 GES－1購自 ATCC細胞庫;HDMEM和RPMI1640細胞培養液購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自BBI公司;青－鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司;組織細胞總RNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Therom公司;SYBR－Green－Kit購自大連TAKARA公司。人KLF4基因序列從美國國家生物技術信息中心在線核苷酸數據庫(Gen Bank)獲得。在線轉錄因子預測軟件包含 Patch、P－Match、MatrixCatch、AliBaba2等;在線基因表達譜數據庫Gene Expression Atlas。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測KLF4 mRNA的表達 參照組織細胞總RNA提取試劑盒說明書，嚴格操作后分別提取兩種細胞的總RNA。以總RNA中的mRNA為模板，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書，將mRNA反轉錄成cDNA，最后用實時熒光定量PCR方法檢測KLF4 mRNA的表達，以GAPDH為內參照，分析產物相對表達量。KLF4上游引物為ATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGC，下 游 引 物 為 GCATCTGATCGGGCAGGAAGGAT;GAPDH上游引物為ACAACTTTGGTATCGTGGAAGGAC，下游引物為 AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG;采用2－△Ct方法分析目的基因表達的相對倍數，△Ct=目的基因Ct值－內參基因Ct值。

1.2.2 KLF4啟動子區序列的獲得 基于KLF4的基因序列ID，應用美國國家生物技術信息中心(NCBI)提供的鏈接獲取啟動子序列。

1.2.3 KLF4啟動子區轉錄因子結合位點分析 通過在線啟動子 區 域 預 測 分 析 軟 件 PromotorScan(http://www－bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)分析啟動子序列，通過轉錄因子數據庫TRANSFAC中的在線轉錄因子預測軟件包括Patch、P－Match、AliBaba2(http://www.gene－regulation.com/pub/programs.html)預測KLF4啟動子序列順式作用元件，分析其可能轉錄因子結合位點。

1.2.4 胃癌組織中相關轉錄因子的篩選 應用在線基因表達譜數據庫Gene Expression Atlas(http://www.ebi.ac.uk/gxa/home)篩查胃癌組織中異常表達的蛋白，與預測的轉錄因子進行對比，獲得目標轉錄因子。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 KLF4 mRNA在胃癌細胞系及胃黏膜上皮細胞系中的表達 實時熒光定量PCR結果顯示，人胃癌細胞株MKN－45和人正常胃黏膜上皮細胞株GES－1中KLF4 mRNA表達量相對比，前者低于后者(6.66±0.23 vs 4.24±0.15，P＜0.01)。

2.2 人KLF4基因基本信息及啟動子序列 人KLF4基因ID:9314，定位于9號染色體負鏈(9q31)，全長4 915 bp，其mRNA ID:NM_004235.4。該基因啟動子 ID:HPRM23684，全長1 319 bp，位于轉錄起始位點－785 bp至 +534 bp之間。

2.3 人KLF4基因啟動子區轉錄因子結合位點預測結果 應用PromotorScan分析啟動子序列結果顯示共57個轉錄因子結合位點，涉及17個轉錄因子，其中Sp1結合位點共22個、GCF共6個、AP－2共8個、UCE.2共4個、T－Ag共 3個。應用 Patch在線軟件分析，參數設置 set of sites選擇“vertebrates”，Lower score boundary設為“90”，其他采用默認設置，預測結果共1 425個轉錄因子結合位點，手工篩查物種為人的轉錄因子結合位點共562個，經匯總去重，共涉及113個轉錄因子。應用P－Match在線軟件分析，當Cut－offs使用參數為“to minimize the sum of both error rates”時，預測到18個轉錄因子結合位點(圖1)，去除重復共涉及9個轉錄因子，當使用參數為“to minimize false negative matches”，共預測到295個轉錄因子結合位點，經匯總去重，共涉及25個轉錄因子，應用AliBaba2在線軟件分析，取在線軟件默認設置參數，預測結果共172個轉錄因子結合位點，經匯總去重，共涉及52個轉錄因子。匯總以上軟件預測結果并去除重復，結果共涉及 183 個轉錄因子:1－Oct、alpha－CBF、AP、AP－1、AP－2、AP－2alph、AP－2alphaA、AP－2alphaB、AP－4、APRT－mouse_US、AREB6、ARP－1、ATF、BRF1、BSAP、C/EBPal、C/EBPalp、CAC－binding、protein、CACCC－bi、CACCC－binding、factor、CAR、CBAF、CBF－B、CBTF、CDP CR3、CDP2、c－Ets－1、c－Ets－2、CF1、c－Fos、c－J、c－Jun、Clox、c－Myb、c－Myc、CP1、CP1A、CP2、CPE_bind、CRE、CREB、CRE－BP1、c－Rel、CTCF、CTF、CUTL1、E1、E2、E2F+p107、E47、EARLY－SEQ1、EGR－1、Elk－1、ER、ER－alpha、ETF、Evi－1、EZF－2、FOR1、FOR2、Fra－1、FXR、gammaCAAT、gammaCAC1、gammaCAC2、GATA－1、GCF、GCN4、GGCGG、GLI3、GLO、GR、GTCAC、H1TF2、H4TF1、H4TF－2、HFH－1、HIF－1、HiNFD、HiNF－M、HiNF－P、HNF－1A、HNF－1B、HNF－1C、HNF－3alpha、HNF－3B、Hp55、Hp65、ISGF－3、JCV_repeated_sequenc、Krox－20、KROX24、LEF－1、LF－A1、LUN－1、LXR－alpha、LXR－beta、MAF、MafG、Max、Max1、MAZ、MEB－1、MIG1、MLTF、MTF－1、MT－I.6、MyoD、myogenin/NF－1、MZF－1、NF－1、NF－1/L、NFAT－1、NF－ATp、NF－E、NF－E2、NF－E3、NF－kappaB、NF－muE1、NF－S、NIP、Nkx2－5、NRF－2Oct－1A、p58、Pax－2、Pax－5、Pax－8、PEA3、PEBP2alphaA1、POU1F1a、PPUR、PuF、PXR－1、R、RAP1、RAR－alph、RAR－alpha1、RAR－beta、RAR－beta2、RAR－gamma、REB1、Ref－1、represso、RFX2、RREB－1、RSRFC4、RXR－alpha、RXR－beta、RXR－gamma、SDR_RS、SMAD－3、SMAD－4、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、SRF、STATx、SXR、T3R、T3R－alpha、T3R－beta1、T3R－beta2、T－Ag、Tax/CREB、TBP、TEC1、TFIID、TMF、TR2－11、UCE.2、USF、USF1、USF2、VDR、v－ErbA、v－Jun、WT1、XBP－1、XFD－2、YY1、ZID。

圖1 P-Match分析KLF4啟動子區順式作用元件

2.4 篩查胃癌中人KLF4啟動子區可能轉錄因子 應用在線基因表達譜數據庫Gene Expression Atlas檢索胃癌中異常表達的蛋白結果共3 249個，與上述預測的183個轉錄因子進行對比，取交集獲得目標轉錄因子。結果預測的轉錄因子中共有17個在胃癌中異常表達:AP－1、AP－2、AP－4、ATF、CTCF、FXR、HIF－1、LEF－1、NF－1、Pax－5、Pax－8、RREB－1、SMAD－4、SP3、SRF、USF1、YY1。

3 討論

伴隨著人類基因組計劃(HGP)的成功，特別是進入到后基因組計劃(Post－HGP)時代，對基因的功能研究已成為熱點之一。本課題所研究的KLF4基因是真核生物中的鋅指蛋白轉錄因子，屬于鋅指蛋白Kruppel家族，位于9q31染色體，含有5個外顯子，其cDNA編碼含470個氨基酸的蛋白，其開放讀碼框包括轉錄激活域、轉錄抑制域、鋅指DNA結合域、核定位信號和潛在PEST序列〔5〕。KLF4基因在細胞增殖、分化、遷移、炎癥中具有調控作用。除此之外，KLF4基因作為胃腸富集型KLF，與消化道腫瘤的發生、發展密切相關。本課題選擇MKN－45和GES－1兩種消化道組織細胞作為研究載體，通過對比檢測兩種細胞中KLF4基因表達情況，提示KLF4基因的表達水平與組織的癌性呈負相關趨勢。Jiang等〔6〕應用免疫組織化學法分析不同分期的胃癌組織后顯示，KLF4蛋白高表達于正常胃組織和癌旁組織，低表達于胃上皮瘤變組織，而在胃腫瘤組織中幾乎無表達，且隨著胃癌分期的遞增，KLF4的表達逐漸減弱。亦有學者通過實驗研究表明KLF4表達率與腫瘤臨床分期、浸潤深度、淋巴結轉移等存在顯著地負相關特性〔7，8〕。細胞質內高表達KLF4基因的胃癌患者與低表達KLF4基因的胃癌患者相比，前者明顯表現出更高的總生存率〔9〕，以上現象說明 KLF4的高表達可產生一定的抑癌作用。

本研究發現人胃癌細胞株MKN－45的KLF4 mRNA表達明顯低于人正常胃黏膜細胞GES－1中KLF4 mRNA的表達，這一點印證了KLF4基因在癌性組織中低表達這一現象。與此同時，胃正常組織與癌變組織中的KLF4定量檢測增添了數據支持;另一方面，也為本課題后續的關于KLF4基因啟動子區調控干預實驗提供相應的研究支持，乃至于為今后以期利用MKN－45作為研究對象的研究人員提供實驗參考依據。但是由于本課題僅選用一種胃癌細胞(MKN－45)與正常人胃黏膜細胞(GES－1)做對比，結果具有一定局限性，是否存在其他更為典型、更為有意義的參照細胞，相信隨著研究深入會被發現與認知。

目前，生物信息學分析方法被廣泛應用于基因的轉錄、調控等方向研究。應用生物信息學方法預測KLF4基因可能的調控元件，具有高效、經濟的等優點，對進一步闡釋該基因的功能等研究工作具有重要作用。本研究中我們預測了KFL4基因啟動子區相關轉錄因子共183個，人胃癌KLF4基因啟動子區可能的轉錄因子17個。這就為擬在KLF4啟動子區作出相關研究的人員提供一個較明確的方向，從而可以利用該生物信息學分析所得出的結果，進行實驗設計等研究工作，起到事半功倍的效果。國外相關研究報道，在KLF4基因5′側翼區核苷酸序列中存在AP－1的結合位點，且KLF4基因受轉錄因子 AP－2、SP3 調控〔10，11〕;在缺氧情況下，KLF4 的表達下調表達受 HIF－1α依賴方式調控〔12〕。這些數據均為我們的預測提供了支持證據，對進一步的研究提供了理論基礎。與此同時，相信我們的研究成果亦可為廣大從事KLF4基因研究的相關人員提供理論及數據上的參考。雖然關于KLF4基因啟動子區相關轉錄因子的預測與實際情況可能會出現一定的偏差，進一步的驗證過程不僅需要生物信息數據庫進行持續的更新與改進，也需要廣大的研究人員不斷提供相應的研究成果來一一佐證。我們應充分重視生物信息學分析方法的作用，利用該方法盡可能地挖掘國內外已有研究成果，從而有效縮小研究范圍，有助于進一步研究在胃癌發生過程中抑癌基因KLF4的轉錄、調控等作用機制，為腫瘤的預測、預防及靶向治療提供探索方向和實驗基礎。

綜上所述，本文再次證實KLF4與胃癌的負相關，同時為下一步的深入研究奠定了基礎。通過運用生物信息學分析方法預測KLF4基因的啟動子區相關調控因子，利用該分析結果指導對KLF4基因轉錄調控機制的探究，試圖在今后的研究中闡釋KLF4基因與消化道腫瘤疾病發生、發展的關系以及在其中的具體作用。著力于基因層面及分子水平為消化道腫瘤疾病的預防與治療提供新的思路與方向。

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Expression of tumor suppressor gene KLF4 in gastric cancer cells and bioinformatics analysis on promoter region of KLF4

YANG Jing，ZHOU Li，XU Zhong.
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang 550002，Guizhou，China

ObjectiveTo explore the expression of KLF4 gene in human gastric cancer cell lines MKN－45 and analyze the gene sequence of KLF4 promoter region in gastric cancer.Methods Real－time PCR was used to detect KLF4 mRNA expression in MKN－45 and GES－1.A variety of online software were used to analyze the sequences of KLF4 gene promoter and predict the binding sites of transcriptional factor and relevant transcription factors in gastric cancer.Results Real－time PCR showed that the KLF4 mRNA level in MKN－45 was significantly lower than that of GES－1(4.24±0.15 vs 6.66±0.23)with significant differences(P＜0.01).The promoter region of KLF4 gene was 4 915 bp long，containing 183 transcriptional factors.Among them，17 transcriptional factors were abnormally expressed in gastric cancer，including AP－1，AP－2，HIF－1，SP3，etc.Conclusions KLF4 mRNA expression is down－regulated in gastric cancer cell line MKN－45.Bioinformatics analysis shows that transcriptional factors AP－1，AP－2，HIF－1 and SP3 may be involved in regulation of KLF4 expression in the development of gastric cancer，which provides theoretical basis for further research.

Kruppel like factor(KLF)4;Gastric cancer;Promoter;Bioinformatics

R73

A

1005-9202(2015)09-2350-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.018

貴州省科學技術基金項目(No.〔2012〕2240)

周 力(1956－)，男，碩士，主任醫師，主要從事消化內科相關疾病研究。

楊 菁(1986－)，女，碩士在讀，主要從事消化內科相關疾病研究。

〔2013－12－09 修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)