bFGF基因轉染MSC目的基因檢測

王彥生 于寧

bFGF基因轉染MSC目的基因檢測

王彥生 于寧

【摘要】目的 探討堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）基因外源性轉染到MSC（骨髓間充質細胞）后，bFGF基因的表達情況。方法 選取SD大鼠，獲取骨髓間充質細胞，分為對照組、陰性對照組（轉染外源性GFP）和實驗組（外源性bFGF轉染MSC），經過體外培養后，應用RT-PCR和ELISE法檢測各組MSC的bFGF基因陽性表達情況。結果 RT-PCR法顯示實驗組bFGF基因表達量（0.73±0.15）高于對照組和陰性對照組（P＜0.05）。ELISA法顯示bFGF基因表達主要集中在胞漿，實驗組bFGF基因表達量[上清為（5.38±0.45）ng/L，胞漿為（8.27±0.82）ng/L]高于其他兩組（P＜0.05）。結論 采用病毒介導基因轉染技術能夠將外源性bFGF轉染至MSC，并能夠成功實現bFGF基因表達。

【關鍵詞】bFGF基因；骨髓間充質細胞；細胞轉染

【

作者單位：110024 沈陽醫學院附屬中心醫院手外科

Detection of bFGF Transfection on MSC Gene

WANG Yansheng YU Ning, Hand Surgery Department, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, China

[Abstract]Objective To discuss the expression of bFGF gene, after basic fibroblast growth factor (bFGF) exogenous transfection to MSC (bone marrow cells). Methods SD rats were selected. The ectomesenchymal cells were obtained from bone marrow. They were divided into control group, negative control group (transfection exogenous GFP) and experimental group (exogenous bFGF transfection on MSC), in vitro culture, bFGF gene positive expression of MSC were detected by the method of RT-PCR and ELISE in each group. Results RT-PCR showed that bFGF gene expression quantity was (0.73±0.15) in experimental group, it was significantly higher than the control group and the negative control group (P<0.05). ELISA showed that bFGF gene expression was mainly in the cytoplasm, the experimental group bFGF gene expression quantity were [supernatant (5.38±0.45)ng/L, cytoplasm (8.27±0.82)ng/L], it was significantly higher than the other two groups (P<0.05). Conclusion The application of virus mediated gene transfection to transfect exogenous bFGF to MSC can successfully achieve bFGF gene expression.

[Key words]BFGF gene, Bone marrow mesenchymal cells, Cell transfection

bFGF具有諸多生物學功效,是形成新生血管的特異性促進因子，而且能夠調控MSC增殖和定向分化[1]。本實驗探討將病毒作載體，通過將外源性bFGF基因染入到MSC后，通過觀察bFGF基因的表達，為更為深入的研究bFGF提供相關動物實驗基礎。

1　材料和方法

1.1 實驗動物

6只近交系SD大鼠均來源與中國醫科大學，體重為（160±10）g。

1.2 主要試劑及儀器

bFGF片段（武漢博士德生物）；DMEM液、乙二胺四乙酸、蛋白酶（美國GIBCO）；PCR儀（美國ABI公司）；核酸電泳儀（北京六一廠）；凝膠成像儀（美國 BIO公司），細胞轉染試劑盒、ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞傳代培養及轉染 斷頸處死SD大鼠后，消毒，取股骨和脛骨，去掉骨表面軟組織，完全顯現骨髓腔，用DMEM液沖洗髓腔后，抽取骨髓并制成細胞懸液，離心去除上清，添加完全培養液，細胞重懸后，用培養瓶接種細胞懸液，室溫下放置到CO2培養箱中，每72 h換液1次，至細胞融合超過80%后，添加乙二胺四乙

酸、胰蛋白酶消化后，進行傳代培養（1∶3）。取3代細胞，分為對照組、陰性對照組和實驗組，實驗組細胞懸液，滴加到培養孔中后，加入bFGF純化液和培養液轉染2 h后進行48 h細胞培養，每24 h更換1次培養基。對照組僅使用培養液，陰性對照組添加純化GFP液和培養液。

1.3.3 檢測指標及方法 應用RT-PCR和ELISA法檢測MSC細胞中bFGF基因的表達情況。

1.4 統計學方法

應用SPSS 15.0軟件，組間計量數據比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

RT-PCR檢測發現對照組bFGF基因表達量為（0.34±0.11）ng/L，陰性對照組表達量為（0.33±0.12）ng/L，實驗組表達量為（0.73±0.15）ng/L，實驗組bFGF陽性表達量高于其兩組（P＜0.05）。ELISA法檢測顯示對照組上清中bFGF基因表達量為（0.18±0.07）ng/L，胞漿表達量為（0.21±0.10）ng/L，陰性對照組bFGF基因表達量為（0.21±0.09）ng/L，胞漿表達量為（0.29±0.10）ng/L，實驗組bFGF基因表達量為（5.38±0.45）ng/L，胞漿表達量為（8.27±0.82）ng/L，實驗組bFGF基因表達量高于另外兩組（P＜0.05）。

3　討論

bFGF血管形成的重要誘導因子之一，其對于血管生成的作用備受關注[2]。本實驗通過病毒載體將外源性bFGF基因成功轉入到MSC內，通過RT-PCR及ELISE檢測證實，轉染細胞能夠bFGF基因陽性部位為細胞漿，MSC轉染后其細胞內外均可出現bFGF蛋白陽性表達，并且其bFGF陽性表達量高于對照組及陰性對照組（P＜0.05），提示外源性bFGF基因轉染大鼠MSC后，能夠得到目的基因表達，且能夠保有生物學活性，促進細胞自身增殖。綜上所述，病毒載體基因轉染法能夠將bFGF基因導入到MSC中，使轉染MSC中bFGF基因持續高表達。

參考文獻

[1]張金池，吳明祥，王玉龍，等. 人堿性成纖維細胞生長因子基因轉染大鼠骨髓間充質干細胞的研究[J]. 中華實驗外科雜志，2010，27(10)：1436-1438.

[2]蔡弢藝，陳雄生，賈連順，等. 堿性成纖維細胞生長因子重組腺病毒轉染兔骨髓間充質干細胞的表型變化[J]. 中國組織工程研究，2014，19(23)：3727-3731.

·研究分析·

項目基金：遼寧省科學技術計劃項目（編號：2012020120-217）

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.18.035

【文章編號】1674-9308（2015）18-0055-02

文獻標識碼】B

【中圖分類號】R394.3