替加環(huán)素、多粘菌素和頭孢哌酮舒巴坦對多重耐藥鮑曼不動桿菌體外抗菌活性的研究*

王康椿 李滿元 余曉騰 刁艷麗

鮑曼不動桿菌是一類革蘭氏陰性、氧化酶陰性、專性需氧的條件致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境，當機體抵抗力降低時，容易引起感染[1]。該菌有多種耐藥基因，如ESBLS、金屬酶、AMPc酶、氨基糖苷修飾酶等，在一定環(huán)境下可以對抗生素產(chǎn)生多重耐藥，甚至泛耐藥[2]。近年來，隨著抗生素的大量使用，而導致多重耐藥鮑曼不動桿菌出現(xiàn)也是常見，這給臨床的治療帶來困難，據(jù)金茜等[3]報道，碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌已經(jīng)在全國各醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播，并且已經(jīng)給臨床上感染性疾病的治療帶來嚴重的挑戰(zhàn)。多粘菌素是通過多粘芽孢桿菌培養(yǎng)液中獲得的一種多肽類抗生素，是臨床上治療多重耐藥鮑曼不動桿菌常用的藥物，但是該藥物副作用較大，在上世紀80年代，因其毒性反應及新藥的產(chǎn)生幾乎被臨床停用，其毒性作用包括神經(jīng)毒性和腎毒性，因此在用法與用量上應注意[4]。替加環(huán)素是一類多肽類的抗生素，是臨床上用于治療多重耐藥鮑曼不動桿菌的感染性疾病新藥物，其對多重耐藥鮑曼不動桿菌仍保持有較高的敏感性[5]。有研究表明頭孢哌酮舒巴坦對多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥性有上升趨勢，這與該藥在臨床上應用增多有關系[6]。

本研究的目的旨在觀察用替加環(huán)素、多粘菌素和頭孢哌酮舒巴坦對多重耐藥鮑曼不動桿菌體外抗菌活性情況，為臨床上多重耐藥鮑曼不動桿菌感染性疾病的用藥提供指導方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月-2014年6月廣東省第二中醫(yī)院檢驗科微生物實驗室，臨床無菌操作收集的各種標本做一般致病菌培養(yǎng)加藥敏試驗培養(yǎng)出的細菌，經(jīng)過菌株分純培養(yǎng)、革蘭染色為陰性的細菌，用VITEK2全自動細菌鑒定儀、ATB革蘭氏陰性細菌鑒定及藥敏卡做鑒定后的菌株50株。

1.2 抗生素類藥敏紙片 替加環(huán)素（TGC）、批號：1352109、濃度 15 UG；多粘菌素（PB）、批號：1326603、濃度：300 UNI；頭孢哌酮舒巴坦（藥物比例為1∶1）（SCF）、批號：1226100、濃度：105 UG；藥敏紙片均來自英國OXOID公司。

1.3 試劑與儀器 MH水解酪蛋白營養(yǎng)平皿由廣州迪景微生物公司生產(chǎn)、法國梅里埃公司VITEK2全自動細菌鑒定儀、ATB細菌鑒定及藥敏卡均由法國梅里埃公司生產(chǎn)、恒溫細菌培養(yǎng)箱、CO2恒溫培養(yǎng)箱。

1.4 質(zhì)量控制菌株 為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、綠膿桿菌ATCC27853、鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606，由廣東省臨床檢驗中心提供質(zhì)控菌株。

1.5 藥敏試驗判斷標準 藥敏試驗用K-B紙片擴散法，按照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2007年的標準進行操作。多粘菌素藥敏紙片的折點為敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm（參考CLSI2012非發(fā)酵菌質(zhì)控標準）；參考張冀霞等[5]在中華檢驗醫(yī)學雜志發(fā)表的研究替加環(huán)素藥敏紙片的折點為敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm；頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片的折點為敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm，參考文獻[7]頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片中的舒巴坦量對藥敏結果的影響。

1.6 方法 將2013年1月-2014年6月收集后保存在-70 ℃冰箱的50株多重耐藥鮑曼不動桿菌取出后，放在室溫恒溫，然后用無菌鑷子夾起沾有多重耐藥鮑曼不動桿菌的細菌保存珠，分別在血平板上分區(qū)劃線，分純轉種，然后放入37 ℃恒溫箱孵育18 h后，在平板上分離出單個菌落，用無菌接種環(huán)挑起純培養(yǎng)的單個菌落，用3 mL無菌生理鹽水調(diào)成菌懸液，用無菌生理鹽水調(diào)零，用麥氏比濁儀比濁，將純培養(yǎng)后的菌落調(diào)成0.5個麥氏濁度的菌懸液，相當于細菌濃度為相當于1.5×109/L，然后用無菌棉簽，蘸取少量該菌懸液，在MH營養(yǎng)平板上密涂，最后在該MH平板上相隔一定距離，用無菌鑷子夾起藥敏紙片，貼上替加環(huán)素、多粘菌素、頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片在相應位置。按上述方法操作，直至做完50株細菌為止，并按照不同藥物分成3個組，分別為替加環(huán)素組、多粘菌素B組、頭孢哌酮舒巴坦組，每組有50株細菌，然后放置37 ℃恒溫箱孵育18 h后，次日，取出MH培養(yǎng)平板，用專用游碼尺測量各個藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，將各個數(shù)值記錄在相應表格上，根據(jù)上述替加環(huán)素藥敏紙片的折點為敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm；頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片的折點為敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm，多粘菌素B藥敏紙片的折點為敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm的標準判斷出各個菌株的藥敏情況[8]。

2 結果

將上述培養(yǎng)18 h后藥敏試驗的MH營養(yǎng)平皿，放在生物安全柜內(nèi)，經(jīng)過準確測量后（測量用的游標尺的誤差在1 mm內(nèi)），將測量結果登記在專用細菌藥敏試驗登記表上，然后再將上述測量結果錄入電腦統(tǒng)計，由另外一人進行核對。用每組藥物的上述藥敏折點進行判斷，將50株多重耐藥鮑曼桿菌不動桿菌分為三類，分別為敏感、中介和耐藥。以敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm為折點時替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌保持較高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三種藥物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm為折點時，多粘菌素B中介敏感性為67%，耐藥性為33%，其敏感性僅次于替加環(huán)素，而敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm為折點時對頭孢哌酮舒巴坦的敏感性為7%，中介敏感性為20%，耐藥性為73%，其耐藥性較高。

3 討論

多重耐藥鮑曼不動桿菌是指對三類或三類以上的抗生素耐藥（如B內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、碳氫酶稀類、喹諾酮類、四環(huán)素類等）的鮑曼不動桿菌。隨著臨床上抗生素廣泛被使用，加上該細菌有多種耐藥基因，導致多重耐藥的鮑曼不動桿菌正在逐年上升，給臨床上治療該菌帶來較大挑戰(zhàn)[9]。研究資料表明多重耐藥鮑曼不動桿菌感染檢出率占鮑曼不動桿菌感染檢出率中的17%，主要發(fā)生在機體抵抗力較弱的人群，如重癥監(jiān)護病房、長期臥床患者、腫瘤患者、糖尿病患者等，該類患者感染前均有長期住院的經(jīng)歷，大多數(shù)是下呼吸道感染為主[10]。據(jù)秦媛怡等[11]研究報道對384例鮑曼不動桿菌感染的病例進行分析，其主要分布在呼吸內(nèi)科，再次是重癥監(jiān)護室、神經(jīng)外科等。本研究指明該菌是從醫(yī)院獲得性感染源，且患者在感染前均使用過大劑量的抗生素，特別是對于用過的碳氫酶稀類、頭孢菌素類及喹諾酮類藥物的多重耐藥鮑曼不動桿菌檢出率較高。本院多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測率2013年1月-2014年6月總檢出593株，總檢出率18.27%，其中多重耐藥鮑曼不動桿菌占17%，以分布在痰液標本為主占71.3%，其次為中段尿7.2%、血液4.3%等。其臨床科室分布特征為：主要分布在重癥監(jiān)護病房（48%）和呼吸科病房（18%）、針灸二區(qū)病房（11%）、心血管科病房（7%）、針灸一區(qū)病房（6%）、其他病區(qū)（12%）。根據(jù)徐一鳴等[12]回顧性分析了2008年-2012年鮑曼不動桿菌臨床感染分布及耐藥特征分析，鮑曼不動桿菌對12種臨床常用抗菌藥物的耐藥率明顯升高，其中對碳青酶烯類抗菌藥物耐藥率為逐年上升，對派拉西林、阿米卡星、慶大霉素、頭孢菌素、等耐藥率總體維持在70%~80%。本研究結果表明，以敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm為折點時替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌保持較高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三種藥物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm為折點時，多粘菌素B中度敏感性為67%，耐藥性為33%，其敏感性僅次于替加環(huán)素，而敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm為折點時對頭孢哌酮舒巴坦的敏感性為7%，中介敏感為20%，耐藥性為73%，其耐藥性較高。導致頭孢哌酮舒巴坦舒巴坦耐藥性上升的因素包括細菌自身的基因因素和外在抗生素的廣泛使用，細菌自身的因素包括該菌有多種耐藥基因，如ESBLS、金屬酶、AMPc酶、氨基糖苷修飾酶等，潘思爭等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌多種抗生素產(chǎn)生耐藥基因?qū)е屡R床上出現(xiàn)多重耐藥鮑曼不動桿菌，甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌。多重耐藥鮑曼不動桿菌導致的感染，治療已經(jīng)是目前臨床上的一大難題，據(jù)Karageorgopoulos等[14]研究碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌已經(jīng)在世界范圍內(nèi)擴散，引起了緊迫的公共衛(wèi)生問題。因此，多重耐藥鮑曼不動桿菌作為醫(yī)院感染的主要致病菌，由于菌株基因型的差異，并有研究證明這些基因型的差異與細菌的多重耐藥性有關系，因此在選用抗菌藥物時應根據(jù)體外藥敏結果指導用藥，提高用藥療效，減少用藥劑量，減少毒性反應，防止或延緩耐藥基因的產(chǎn)生[15]。

通過上述研究證實替加環(huán)素作為一種較新的抗生素，在對多重耐藥鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性試驗中保持著較高的敏感性，其中介敏感度為33%，高度敏感度為67%，多粘菌素B多重耐藥鮑曼不動桿菌的中介敏感性為67%，也能抑制該菌的生長。因此，替加環(huán)素和多粘菌素B，可以用作治療多重耐藥鮑曼不動桿菌引起的各種感染性疾病的抗菌藥物之一。

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